研究背景和目的:血管性认知功能障碍是指由脑血管病危险因素和脑血管病引起的认知障碍,包括从轻度认知障碍到痴呆的一大类综合征。缺血性脑白质损伤是血管性认知功能障碍的主要原因之一,是动脉硬化性脑病的基本病理表现,也是中老年血管性认知损害的主要病理类型。缺血性白质损伤病变的病理特点是血脑屏障的破坏、胶质细胞增生和脱髓鞘改变。其确切的分子病理机制尚不明确,目前认为主要与氧化应激损伤、突触结构和功能异常和中枢胆碱能及单胺能系统神经递质功能紊乱有关。最近的研究表明炎症和免疫机制在慢性脑缺血白质损伤中发挥重要的作用。腺苷是一种重要的胞外信号分子,通过激活四个G蛋白偶联受体A1、A2A、A2B和A3腺苷受体参与调节机体生理和病理过程。在细胞氧化应激和组织炎症缺氧时,胞外腺苷浓度明显增加。胞外腺苷作为一种重要的免疫抑制性分子通过结合效应细胞的G-蛋白偶联受体调节免疫和炎症反应,是一个关键的内源性免疫调节机制。胞外腺苷有两个来源:第一,细胞内生成腺苷转运至胞外。第二,通过CD39和CD73的协同作用,将胞外腺嘌呤核苷(ATP、ADP)分解产生大量的腺苷,其中,CD73是限速酶。通过CD73基因敲除小鼠证实CD73是小鼠脑内最主要的5’核苷酸酶,占所有AMP水解能力85-95%。上述结果表明CD73可能通过调节胞外腺苷水平在脑部疾病的免疫炎症中发挥重要的作用。Braun等报道CD73在大鼠大脑中动脉闭塞模型脑梗死组织中表达明显增加。Petrovic等发现CD73基因敲除小鼠在急性缺血性脑损伤模型中损伤和炎症水平明显高于野生型小鼠,说明CD73在急性缺血性脑损伤中是一种防御性调节炎症反应机制。我们前期的研究也表明腺苷A2A受体敲除加重慢性脑缺血脑白质损伤,证实胞外腺苷通过作用于A2A受体会影响慢性低灌注性脑白质损伤的病理过程。但是CD73作为胞外腺苷产生的限速酶,其在慢性低灌注性脑白质损伤中的表达和功能尚不清楚。第一部分小鼠双侧颈总动脉套扎微型弹簧圈制作慢性低灌注性脑白质损伤模型按照shibata等方法分离小鼠双侧颈总动脉,然后用内径0.18毫米的微型弹簧圈分别套扎左右两侧颈总动脉建立慢性低灌注性脑白质损伤小鼠模型(bilateralcommoncarotidarterystenosissurgery,bcas)。假手术组(sham组)小鼠的处理方法为暴露双侧颈总动脉不圈套微型弹簧,其余处理同bcas模型组。在手术后第30天通过y型迷宫自发交替实验和八臂迷宫实验检测模型小鼠认知功能改变,通过kluver-barrera染色评价胼胝体脑白质脱髓鞘程度,通过抗gfap、iba-1免疫组织化学染色观察模型小鼠在建模后30天胶质细胞增生程度。第二部分cd73在慢性低灌注性脑白质损伤的表达和活性改变在建模第30天通过westernblot检测慢性低灌注性脑白质损伤小鼠胼胝体cd73表达变化,cd73免疫组化染色检测慢性低灌注性脑白质损伤小鼠胼胝体cd73的表达分布。cd73和gfap/iba-1免疫双标荧光染色检测胼胝体cd73表达细胞。5’-核苷酸酶检测试剂盒检测慢性低灌注性脑白质损伤小鼠胼胝体cd73活性变化。第三部分cd73基因敲除对慢性低灌注性脑白质损伤的影响将cd73基因敲除小鼠(bcas-ko)及其野生型小鼠(bcas-wt)分别通过微型弹簧圈套扎左右两侧颈总动脉制作慢性低灌注性脑白质损伤小鼠模型。假手术组cd73基因敲除小鼠(sham-ko)及其野生型小鼠(sham-wt)小鼠的处理方法为暴露双侧颈总动脉不圈套微型弹簧,其余处理同bcas模型组。在手术后第30天通过y型迷宫自发交替实验和八臂迷宫实验检测模型小鼠认知功能改变;通过kluver-barrera染色评价胼胝体脑白质脱髓鞘程度,通过抗gfap、iba-1免疫组织化学染色观察模型小鼠在建模后30天胶质细胞增生程度。采用elisa检测模型小鼠在建模第30天胼胝体的tnf-α、il-1β和il-6水平。结果:第一部分慢性低灌注性脑白质损伤小鼠出现工作记忆损伤、白质疏松和胶质细胞激活八臂迷宫实验表明bcas组小鼠工作记忆错误显著高于sham组表明慢性低灌注能导致空间学习记忆障碍。另外y型迷宫小鼠自发交替实验发现bcas组小鼠工作记忆错误显著高于sham组,而两组的自发运动能力没有显著差别。kluver-barrera染色可见bcas小鼠胼胝体神经纤维稀疏、空泡形成、空隙增加,而sham组未见明显改变提示慢性低灌注能导致白质损伤。gfap、iba-1免疫组织化学染色显示bcas组星型胶质细胞和小胶质细胞增生明显而sham组未见明显改变。方法:第二部分慢性低灌注脑白质损伤小鼠胼胝体CD73表达和活性增强Western blot结果表明BCAS组小鼠胼胝体CD73表达相比于Sham组明显增加。CD73免疫组化结果提示慢性低灌注性脑白质损伤小鼠胼胝体脑室旁白质可见大量CD73免疫阳性细胞。我们采用CD73和GFAP/Iba-1免疫双标荧光染色发现慢性脑血流低灌注白质损伤小鼠胼胝体CD73免疫阳性细胞主要是星形胶质细胞。CD73活性测试表明BCAS组小鼠胼胝体5’-核苷酸酶活性相比于Sham组明显增强。第三部分CD73基因敲除加重慢性低灌注性脑白质损伤,促进胶质细胞激活和释放炎性因子八臂迷宫实验表明BCAS-KO组小鼠工作记忆错误显著高于BCAS-WT组,表明CD73基因敲除加重慢性低灌注导致的空间学习记忆损伤。另外Y型迷宫自发交替测试发现BCAS-KO组小鼠工作记忆错误显著高于BCAS-WT组,而两组的自发运动能力没有显著差别。Kluver-Barrera染色可见BCAS-KO小鼠胼胝体白质疏松程度明显高于BCAS-WT组提示CD73基因敲除加重慢性低灌注白质损伤。GFAP、Iba-1免疫组织化学染色显示BCAS-KO组星型胶质细胞和小胶质细胞增生明显高于BCAS-WT组提示CD73基因敲除能够促进胶质细胞活化和增殖。ELISA检测显示BCAS-KO组和BCAS-WT组小鼠胼胝体TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白水平均增高,BCAS-KO组小鼠胼胝体TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子蛋白水平增高比BCAS-WT组小鼠更加显著。研究结论基于以上研究结果,我们得出以下研究结论:通过在小鼠双侧颈总动脉套扎内径为0.18毫米的弹簧圈,我们成功地构建慢性低灌注性脑白质损伤小鼠模型。主要表现为空间学习记忆障碍,脑白质疏松和胶质细胞的激活。慢性低灌注性脑白质损伤小鼠胼胝体CD73表达和活性明显增强。CD73基因敲除能够进一步加重脑白质损伤导致的空间学习记忆障碍,其机制主要与CD73基因敲除增强星形胶质细胞和小胶质细胞的活化和增殖,释放更多炎性因子包括TNF-α、IL-1β和IL-6有关。我们的研究表明CD73在慢性低灌注脑白质损伤中表达和活性增高是一种代偿性保护机制,可作为治疗慢性缺血性脑损伤的治疗靶点