背景和目的:上尿路尿路上皮肿瘤(Upper tract urinary carcinoma,UTUC)包括肾盂癌和输尿管癌,随着人类寿命的延长和检查手段的提高,在我国的发病率和检出率有日益增长的趋势,该疾病具有多发、复发、预后较差等特点,尽管有根治性肾,输尿管及膀胱袖状切除术(Radical nephroureterectomy with excision of the bladder cuff)作为金标准手术治疗方案,但仍有部分患者术后病情继续发展,其中的重要因素是肿瘤床及区域淋巴结或其他器官、部位的转移,对于该部分患者的预后监测工作,对于提高疾病治疗效果至关重要。本课题设计思路的产生,伊始于我们在临床手术过程中,发现经过根治性手术治疗后上尿路上皮癌患者,其手术切除下来的肿瘤组织形态和质地硬度不近相同,有些肿瘤生长方式呈现菜花状形状,生长方向通常由尿路上皮向管腔内生长,肿瘤质地软,我们称之为乳头菜花型UTUC(Papillary Type UTUC);而有些肿瘤生长方式呈现基底样或鱼肉样形状,生长方向通常由尿路上皮向管壁内生长,肿瘤质地较硬,我们称之为基底僵硬型UTUC(Sessile Type UTUC)。国外相关文献报道两种类型肿瘤形态在疾病进展和预后生存方面存在一定差异,而国内相关报道极少,因此本研究首先通过回顾性研究探讨肿瘤形态对于上尿路上皮肿瘤患者疾病复发和预后生存方面的影响,由于纳入研究的患者数量有限,我们进一步将国内外相关主题的文章进行了检索,通过循证医学中的meta分析,进一步合并各项研究中的权重,为揭示肿瘤形态和上尿路上皮肿瘤之间的关系,提供客观而真实的结论。从宏观临床病例统计后,我们拟应用剪切波弹性成像和肿瘤基质比例测量,分别对乳头菜花型肿瘤和基底僵硬型肿瘤进行外部组织力学和内部肿瘤成分分布的检测,应用免疫组化染色方法,对两种类型肿瘤的组织样本进行Ⅰ型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白和层粘连蛋白进行染色,探讨基质内部结构在两种类型肿瘤中的分布情况;采用mRNA表达谱芯片技术、荧光定量PCR等技术检测两种类型肿瘤在基因表达水平变化,筛查差异表达基因,进行系统聚类分析,利用生物信息学工具筛选与信号通路相关的基因及通路;同时在细胞水平,拟建立尿路上皮肿瘤的基质力学研究模型:获得相应的基质硬度3 kPa、10 kPa、19 kPa,进行尿路上皮肿瘤细胞系5637的培养,观察肿瘤细胞形态学变化、Ki67增殖指数、增殖蛋白Cyclin D1、C-myc、Ki67及其信号通路的机制探讨,旨在证明基质力学中不同硬度培养环境对5637细胞系增殖行为的影响。研究方法:1.分析乳头菜花型UTUC和基底僵硬型UTUC的临床病理特征及预后生存差异收集大连医科大学附属第一医院2005年10月1日至2015年10月1日期间收治的单侧尿路上皮肿物患者,经过严格纳入排除标准,进行病例资料收集及预后随访,采用SPSS 21.0统计学软件进行统计处理。由于纳入研究的患者数量有限,我们进一步对国内外相关主题的文章进行了检索,通过循证医学中的meta分析,以美国国立医学图书馆数据库网上检索Pubmed数据库、Medline数据库、荷兰医学文摘数据库Embase和循证医学协作网数据库Cochrane数据库,作为国外文献的主要来源,采用Cochrane协作网提供的Stata 13.0软件做Meta分析。2.检测乳头菜花型UTUC和基底僵硬型UTUC生物力学性质和肿瘤基质成分比例差异建立离体上尿路上皮肿瘤的剪切波弹性成像检测模型,定量分析两种类型肿瘤弹性值图像结果;对组织病理切片进行HE染色,测量两种类型肿瘤基质比例结构变化;对组织病理切片进行免疫组化染色,比较两种类型肿瘤在Ⅰ型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白和层粘连蛋白表达差异。3.比较乳头菜花型UTUC和基底僵硬型UTUC在基质力学相关基因表达谱的差异利用mRNA表达谱芯片筛选乳头菜花型UTUC和基底僵硬型UTUC差异性基因表达谱,通过火山图和散点图进行识别差异性基因分布,使用R脚本进行层次聚类,使用标准的富集计算方法进行GO分析和Pathway分析;qRT-PCR验证mRNA表达谱芯片结果,挑选因子进行验证:COL1A1、COL3A1、COL4A1、LAMA1、LOX、MMP2、CAV1、VIM、FN1、ITGFB1、EGFR、ITGB3、Ki67、C-myc、CCND1、CD9。4.探讨基质力学参与尿路上皮癌细胞5637增殖调控及分子机制研究制备不同比例的聚丙烯酰胺凝胶,建立尿路上皮肿瘤基质力学培养体系,将56372细胞分别接种在3 kPa、10 kPa、19 kPa的聚丙烯酰胺薄膜上,观察不同时间段,记录细胞的铺展面积、周长、长轴、短轴等。利用Imagetod软件计算形变参数:细胞形变因子(Cells deform factor,CF)和细胞长短径比值(Ratio of long diameter to short diameter);应用免疫荧光染色计算Ki67增值指数;免疫印迹试验检测不同基质硬度培养下,增殖相关蛋白 Cyclin D1、C-myc、Ki67、整合素亚型 Integrin β1、Integrin β3、Integrin α4、Integrin α5、GSK-3β/β-catenin 信号通路蛋白 p-GSK-3β、p-β-catenin、TCF1、TCF4 等蛋白含量变化。结果:1.两种生长形态的上尿路上皮肿瘤临床病理特征及预后生存分析回顾性队列研究显示101例上尿路上皮肿瘤,患者根据肿瘤生长形态(Tumor Architecture)分类为乳头菜花型UTUC和基底僵硬型UTUC两类,卡方检验和Spearman相关分析显示肿瘤生长形态分别和肿瘤位置和组织学分级呈正相关性。Kaplan-Meier曲线显示基底僵硬型患者的无复发生存期(Recurrence-free survival,RFS)显著低于乳头菜花型患者,在Cox多因素分析显示肿瘤形态和Ki67染色指数是UTUC患者RFS的独立危险因素。Kaplan-Meier曲线显示基底僵硬型患者的肿瘤特异性生存期(Cancer-specific survival,CSS)显著低于乳头菜花型患者,在Cox多因素分析显示病理分期是UTUC患者CSS的独立危险因素。Meta分析显示基底僵硬型肿瘤患者在RFS和CSS方面显著低于头菜花型肿瘤患者。2.检测乳头菜花型UTUC和基底僵硬型UTUC生物力学性质和肿瘤基质成分比例差异经过剪切波弹性超声测定发现,基底僵硬型肿瘤病灶内50%以上显示为红色及黄色,相对硬度较高。乳头菜花型肿瘤图像主要表现为50%以上显示为蓝色或绿色,质地相对较软,两者相比,平均弹性值呈现显著差异。肿瘤基质成分比例测定发现,基底僵硬型肿瘤中,基质比例较多,而乳头菜花型肿瘤中,基质比例较少;免疫组化染色结果发现COL1A1、LAMA1、COL4A1在两种类型尿路上皮肿瘤中免疫组化评分存在明显差异。以COL1A1染色为例,在乳头菜花型肿瘤中,COL1A1沿着肿瘤形态排列,呈现叶脉状,肿瘤含量明显高于基质成分,而在僵硬基底型肿瘤中,COL1A1排列杂乱无序,基质部分很多。3.比较乳头菜花型UTUC和基底僵硬型UTUC在基质力学相关基因表达谱的差异绘制整体聚类图可直观反映两种类型UTUC差异性mRNA的表达,基底僵硬型和乳头菜花型肿瘤相比,变化2倍以上差异性mRNAs的共3869条,其中上调的共2644条,占总mRNAs的68.3%,下调的共条1225,总mRNAs的31.7%,其中差异性基因包括细胞外基质组份、细胞外基质重塑、基质力学生物信号通路、增殖相关因子等方面,进一步将差异性表达基因纳入至KEGG数据库中,进行Pathway分析,在生物力学和细胞外基质相关通路中,差异通路包括:细胞外基质组成通路、细胞外基质降解通路、细胞基质粘附通路、组织重塑通路、组织重塑通路、细胞组分运动调控通路、力学刺激反应通路、细胞基底粘附通路、力学刺激细胞反应通路、力学行为通路。实时荧光定量PCR检测发现相对于乳头菜花型肿瘤,基底僵硬型肿瘤中表达上调基因的基因包括:COL1A1、COL3A1、COL4A1、LAMA1、LOX、MMP2、CAV1、VIM、FN1、ITGFB1、EGFR、ITGB3、Ki67、C-myc、CCND1,表达下调的基因包括CD9,结果与上部分芯片检测的结果是一致的。4.基质力学参与尿路上皮癌细胞5637增殖调控及分子机制将尿路上皮癌细胞系5637接种至3kPa、10 kPa、19 kPa的基质硬度进行培养,发现在相同观察时间段下,随着基质硬度的增加,5637细胞数量上明显增加,Ki67增殖指数显著增加,细胞之间融合面积有所增加,细胞形态更加细长,长短径比和球形指数逐渐增加,形变程度明显。增殖相关蛋白Cyclin D1、C-myc、Ki67及p-GSK-3β、β-β-catenin、TCF1、TCF4通路蛋白含量增加。同时检测整合素家族中四种主要亚型,整合素Integrin β1、Integrin β3、Integrin α4、Integrin α5,结果显示随着基质硬度的增加,Integrin β1表达含量增加,而Integrin β3、Integrin α4、Integrin α5表达含量无明显差异,故选取Integrin β1作为关键力学因子信号进行下游分子基质的研究。分别采用Integrin β1 SiRNA序列对Integrin β1进行干扰,5637细胞中的Cyclin D1、C-myc、Ki67蛋白水平被明显抑制,GSK-3β/β-catenin通路磷酸化水平明显降低,进一步应用GSK-3β蛋白酶抑制剂对GSK-3β进行抑制,结果发现抑制GSK-3β后,β-β-catenin和β-catenin含量明显增加,促进与转录因子结合,引起Cyclin D1、C-myc、Ki67蛋白含量增加。结论:1.肿瘤生长形态分别和肿瘤位置和组织学分级呈现正相关性;与乳头菜花型肿瘤患者相比,基质僵硬型肿瘤患者的RFS和CSS明显降低,其中肿瘤生长形态和Ki67指数是RFS独立危险因素;进一步循证医学meta分析显示基底僵硬型肿瘤患者在RFS和CSS方面显著低于头菜花型肿瘤患者。2.在宏观组织基质力学方面,基底僵硬型肿瘤平均弹性值明显高于乳头菜花型肿瘤弹性平均值;在微观肿瘤基质分布方面,基底僵硬型肿瘤基质比例较多,明显多于乳头菜花型肿瘤中,进一步免疫组化染色显,示细胞外基质主要蛋白COL1A1,LAMA1,COL4A1含量在基底僵硬型肿瘤的水平高于乳头菜花型肿瘤中。3.基底僵硬型肿瘤与乳头菜花型肿瘤相比,细胞外基质组份、细胞外基质重塑、基质力学生物信号通路相关基因、增殖相关基因存在明显差异;差异表达基因涉及多个生物力学相关通路,包括细胞外基质组成通路、细胞外基质降解通路、细胞基质粘附通路、细胞组分运动调控通路、力学刺激细胞反应通路。4.在尿路上皮肿瘤基质力学模型中,显示基质力学调控尿路上皮癌5637细胞形态学变化和增殖能力,通过力学信号因子Integrin β1调节增殖相关蛋白含量Cyclin D1、C-myc、Ki67及GSK-3β/β-catenin相关信号通路表达影响。