论文部分内容阅读
背景与目的基质溶解素(matrilysin,MMP7)是一种是一种锌离子依赖性的蛋白水解酶[1],广泛表达于包括肺腺癌在内的多种肿瘤组织中。研究发现,MMP7可以降解细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和基底膜(basement membrane,BM) [2-3],在肿瘤细胞浸润、迁移和转移中起重要作用;MMP7还可以影响多种肿瘤细胞膜受体表达,导致细胞信号转导异常,促进肿瘤细胞增殖,抑制凋亡[4-5]。在发现MMP7高表达于非小细胞肺癌组织的前期工作基础上,本研究通过反义基因技术体外抑制肺腺癌A549细胞MMP7的表达,检测对A549细胞体外增殖、粘附、凋亡敏感性、侵袭能力的影响。研究方法①设计和构建针对MMP7 mRNA的采用硫代磷酸修饰的反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, ASODN)和错义寡核苷酸(scrambled oligodeoxynucleotide ,SCODN)通过脂质体介导转染A549细胞。②RT-PCR和免疫组化检测MMP7 ASODN转染对A549细胞MMP7 mRNA和蛋白表达的影响,以未转染组和SCODN转染组细胞为对照。③细胞增殖实验观察MMP7 ASODN对A549细胞体外增殖能力的影响。MTT比色法检测A549- ASODN组(反义寡核苷酸转染)、A549- SCODN组(错义寡核苷酸转染)、A549对照组(未转染)光吸收值。倒置显微镜、透射电镜下观察MMP7 ASODN转染后A549细胞形态、细胞超微结构的变化。流式细胞仪观察MMP7 ASODN对A549细胞周期的影响。④免疫组化和流式免疫荧光术检测MMP7 ASODN对A549细胞Fas抗原表达的影响。采用人工合成的重组FasL诱导凋亡,流式细胞仪检测A549- ASODN组与A549对照组、A549- SCODN组之间细胞凋亡率的差异。⑤体外细胞-基质粘附实验检测MMP7 ASODN对A549细胞的粘附能力的影响。Transwell侵袭实验观察A549- ASODN组和A549对照组之间细胞侵袭能力的差异。结果①RT-PCR结果显示:和A549- SCODN组、A549对照组相比,A549- ASODN组MMP7 mRNA表达显著降低(P<0.01),免疫组化检测结果显示MMP7蛋白表达显著下降。②MTT比色法检测细胞增殖表明:不同浓度ASODN转染组与SCODN对照组和A549对照组比较,均能抑制A549细胞的增殖(P<0.05),且对细胞生长抑制作用随ASODN浓度的增加而增高。5μmol/L的ASODN转染组和7.5μmol/L的ASODN转染组抑制A549细胞的增殖状况无显著性差异(P>0.05)。抑制作用在48h最强。转染ASODN后,相差显微镜下观察发现A549细胞体积变小,数目减少。电镜下观察发现细胞肿胀,透亮度增加,细胞核内染色质变淡,胞浆内可见空泡样变,线粒体水肿,内质网水肿。FCM检测发现MMP7 ASODN可以抑制A549由G0/G1期进入S期。③免疫组化和流式免疫荧光术检测发现,MMP7 ASODN转染A549细胞后,和A549对照组、A549- SCODN组相比,ASODN转染组Fas抗原表达上调(P<0.01)。加入人工合成的重组FasL诱导凋亡,A549- ASODN组凋亡率明显高于A549对照组和A549- SCODN组,组间比较有显著性差异(P<0.01)。④体外细胞-基质粘附实验表明:A549- ASODN组粘附率明显低于A549对照组,两组间比较有显著性差异(P<0.05)。体外细胞Transwell侵袭实验发现:A549- ASODN组穿膜细胞数明显低于A549对照组,组间比较有显著性差异(P<0.01)。结论①硫代磷酸修饰的MMP7反义寡核苷酸能够有效抑制A549细胞MMP7基因和蛋白的表达。②MMP7 ASODN能抑制A549细胞由G0/G1期进入S期,引起细胞超微结构改变,抑制细胞增殖。③MMP7 ASODN转染A549细胞后,细胞膜Fas抗原表达上调,凋亡敏感性增强。④MMP7 ASODN转染能显著降低A549细胞粘附力和侵袭力。