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肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia,KP）属于革兰阴性肠杆菌科（Enterobacteriaceae）细菌,主要分布在人和动物的消化系统及自然环境中,是一种人畜共患的条件性致病菌。许多研究显示,肺炎克雷伯菌不仅可以感染人、家畜家禽（猪、牛、鸡）等,在野生动物（大熊猫、水貂、穿山甲、小熊猫、东非黑白疣猴等）中的流行也非常普遍,其主要通过呼吸道、泌尿生殖道、消化道、血液循环系统感染而导致动物发病。目前,国内外对于大熊猫源肺炎克雷伯菌的生物学特性的研究较少。本研究通过对成都大熊猫繁育研究基地采集的部分健康大熊猫粪便进行肺炎克雷伯菌的分离,并对分离到的肺炎克雷伯菌进行形态学、16S r RNA及特异性引物khe基因PCR扩增鉴定,进一步对鉴定的大熊猫源肺炎克雷伯菌的高黏性表型、毒力基因、生物被膜形成能力、耐药表型和致病性等部分生物学特性进行研究,旨在为预防和控制大熊猫肺炎克雷伯菌的感染提供实验数据和参考依据。研究结果如下:1、大熊猫源肺炎克雷伯菌的分离鉴定本研究对成都大熊猫繁育研究基地从2020年夏季采集的50只健康成年大熊猫粪便样本中分离鉴定的细菌肺炎克雷伯菌,通过平板划线培养的菌落进行形态观察、革兰染色镜检和16S r RNA及肺炎克雷伯菌溶血素基因的PCR扩增鉴定,鉴定出了46株肺炎克雷伯菌,分别来自46只大熊猫。为进一步开展大熊猫源肺炎克雷伯菌的相关研究提供了材料。2、大熊猫源肺炎克雷伯菌生物学特性对46株肺炎克雷伯菌进行荚膜染色、高黏性表型、毒力基因、生物被膜形成能力、耐药表型的研究结果表明,46株肺炎克雷伯菌均可形成荚膜;其中12株菌为高黏性肺炎克雷伯菌,其余34株为非高黏液性肺炎克雷伯菌;46株菌均为多重耐药,其中对氨苄西林、苯唑西林呈100%耐药,对部分头孢类药物、多西环素、复方新诺明、甲氧苄氨嘧啶等呈不同程度耐药;肺炎克雷伯菌的15种毒力基因rmp A、mag A、fim H、mak D、wab G、ug E、ybt A、ure A、iuc A、alls、iut A、ent B、aero、iuc B、kfu的检出率分别为2.17%（1/46）、2.17%（1/46）、67.39%（31/46）、84.78%（39/46）、82.61%（38/46）、80.44%（37/46）、17.39%（8/46）、91.30%（42/46）、2.17%（1/46）、36.96%（17/46）、0%（0/46）、63.04%（29/46）、0%（0/46）、2.17%（1/46）、36.96%（17/46）,其中检出率最高的是ure A基因,为91.30%（42/46）,rmp A、mag A、iuc A、iuc B检出率为2.17%（1/46）,且同时存在于1株分离菌株中,未检测到iut A和aero,有1株分离菌携带13种毒力基因,31株分离菌携带5～7种毒力基因,有3株分离菌株未检测到任何毒力基因。生物被膜形成能力结果显示,在分离得到的46株肺炎克雷伯菌中,其中有13株肺炎克雷伯菌株为中等强度生物被膜形成能力的菌株,17株肺炎克雷伯菌的生物被膜形成能力较弱,有16株肺炎克雷伯菌没有形成生物被膜。本研究明确了大熊猫源肺炎克雷伯菌的主要生物学特性。3、大熊猫源肺炎克雷伯菌致病性研究以肺炎克雷伯菌的主要与致病力相关的生物学特性,即有无黏性、生物被膜形成能力、有无荚膜、耐药情况和毒力基因的携带情况作为致病菌株筛选的依据,选择1株具有黏性、有荚膜、多重耐药、生物被膜形成能力强,同时携带最多13种毒力基因的菌株pneumoniae-X-5,研究其对昆明小鼠的致病性。测定该菌株对昆明小鼠的LD50,分析感染死亡小鼠组织器官的病理变化。试验菌株pneumoniae-X-5和肺炎克雷伯菌参考菌株ATCC700603以同种方式和相同细菌数不同剂量组经腹腔注射攻毒感染昆明小鼠。结果攻毒后3～6 h内,试验菌株组和参考菌株ATCC700603组小鼠均开始出现精神萎靡,趴卧于鼠笼中,不愿活动,被毛凌乱无光泽,呈腹式呼吸,眼睛半睁,眼神无光,个别小鼠眼部伴有渗出物和腹泻等症状,采食和饮水量明显减少。其中高剂量组小鼠(7×10~8 CFU～7×1010CFU)在攻毒5 h后开始陆续死亡,剖检死亡小鼠可见肺脏、肝脏、脾脏肿胀并伴有出血现象,脾脏出血较为明显,胃胀气,肠道内容物稀薄,小肠壁变薄,肠道出血。而肺炎克雷伯菌参考菌株ATCC700603对照组小鼠在攻毒12 h后陆续死亡,但相较于试验菌株攻毒小鼠,其临床症状较轻,病程较缓慢。根据改良寇氏法计算得出试验菌株对小鼠的半数致死量为1.7×10~4CFU/m L。表明试验菌株pneumoniae-X-5对小鼠具有较强的致病性。死亡小鼠肝、脾和肺组织切片,HE染色后观察可见试验菌株组肺部有少量炎性细胞浸润,肺泡间隔增厚;试验菌株组和标准阳性对照组肝细胞均变性坏死、崩解;脾充血;试验菌株组的十二指肠黏膜上皮和固有层分离,肠粘膜固有层的部分细胞坏死;标准阳性对照组中央乳糜管轻微扩张。本研究明确了生物学特性明显、携带多种毒力基因的大熊猫源肺炎克雷伯菌较强的致病性,提示应注意大熊猫等珍稀动物肺炎克雷伯菌病的防控。