背景及目的脑胶质瘤起源于脑部神经胶质细胞,是颅内原发肿瘤中发病率、死亡率最高的肿瘤,能够迅速增长,并具有较强的侵袭能力。据文献报道,我国胶质瘤的年发病率为3-6人/10万,年死亡人数达到3万,是最常见的原发性恶性脑部肿瘤。胶质瘤的治疗方式目前以综合治疗,即手术切除、放射治疗和化学治疗为主,但是由于胶质瘤早期就已呈现浸润性生长并向周围脑组织侵袭,手术难以完全切除,术后易复发,临床治疗疗效不满意。因此,需要有效的预后指标来协助判断术后有复发和远处转移的高危患者,对他们进行有效的综合治疗,延长生存期和提高生存率。肿瘤坏死因子受体超家族成员6B (Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6B, TNFRSF6B),也称诱捕受体3(decoy receptor3, DcR3)或者M68,或肿瘤坏死受体因子6(tumor necrosis receptor factor 6, TR6)。它是肿瘤坏死因子受体家族的成员,是可以与某些蛋白配体特异性结合的受体蛋白分子,通过竞争性抑制死亡受体(death receptor)与配体的结合,继而可以阻断后者诱导所产生的细胞凋亡等信号通路。绝大多数恶性肿瘤TNFRSF6B呈高表达,并在恶性肿瘤的发生,发展,转移等过程中发挥着重要作用。研究证实在多种恶性肿瘤的组织和血清中存在TNFRSF6B mRNA和蛋白的过度表达的情况,其中就包括了胶质瘤。仅有三篇报道关于TNFRSF6B在胶质瘤的发生、发展及增殖、凋亡过程中的研究,但其中作用和机制不清楚,还需要进行进一步深入的研究和探讨。本文通过研究胶质瘤组织及胶质瘤细胞系中TNFRSF6B蛋白的表达情况及其与临床病理特征之间的关系,阐明TNFRSF6B在胶质瘤组织中的表达及临床意义;同时探讨TNFRSF6B对胶质瘤细胞生长及凋亡的作用及潜在分子机制,为胶质瘤预后判断提供生物标记物及为分子靶向治疗筛选有益的靶点。材料与方法1.构建胶质瘤组织微阵列,应用免疫组织化学的方法(EnVision法),检测TNFRSF6B蛋白在125例胶质瘤组织和18例正常脑组织中的表达和相对含量,并分析TNFRSF6B蛋白的表达水平与胶质瘤临床病理特征、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达、Ki-67表达、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)表达及病人生存的关系。2.筛选高表达TNFRSF6B的胶质瘤细胞系；将TNFRSF6B中和性抗体加入胶质瘤细胞系(U251MG, LN-308, U87MG)中,通过MTS. CellTiter-Blue Cell Viability Assay、软琼脂集落形成及Hoechst33342/碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)荧光双染实验检测不同浓度TNFRSF6B中和性抗体作用于不同胶质瘤细胞后的细胞存活率；流式细胞仪(Flow cytometry, FCM)检测TNFRSF6B中和性抗体加入后胶质瘤细胞细胞周期的差异；通过FCM、Caspase-3/7活性检测、Hoechst33342/PI荧光双染等实验分析TNFRSF6B中和性抗体对凋亡的影响；并使用western blot对TNFRSF6B中和性抗体作用后的胶质瘤细胞进行细胞存活,凋亡及侵袭相关的信号通路蛋白检测,包括MMP-2,ERK1/2, AKT等。对TNFRSF6B在胶质瘤发生发展过程的作用以及对胶质瘤细胞各种生物学功能的影响进行探讨,为TNFRSF6B日后的临床应用奠定实验基础。3.统计学分析应用SPSS 20.0统计分析软件包处理数据,计量资料以均数±标准误(Mean±SEM)表示。肿瘤组织及正常脑组织中TNFRSF6B及GFAP蛋白表达强度差异使用Mann-Whitney U检验,阳性率差异使用卡方检验；胶质瘤中TNFRSF6B及GFAP蛋白表达强度及表达率在不同病理分级中的差异使用Kruskal-Wallis检验；胶质瘤中TNFRSF6B及GFAP蛋白表达强度在不同年龄、性别组的差异使用Mann-Whitney U检验,阳性率差异使用卡方检验；胶质瘤中TNFRSF6B及GFAP蛋白表达与病理分级的关系使用Spearman秩相关检验。Ki-67、PCNA LI等计量资料的相关统计如满足正态分布及方差齐性的要求,两组比较用成组t检验,包括胶质瘤vs正常脑组织；病理分级Ⅰ-Ⅱ组vs Ⅲ-Ⅳ组;TNFRSF6B阳性组vs阴性组等。多样本均数比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差齐时采用SNK-q检验(Student-Newman-Keuls)进行两两间显著性检验,方差不齐时先变量转换,如仍不齐则用秩和检验中的H检验法(Kruskal-Wallis)多组比较用方差分析,如Ki-67、PCNA LI在TNFRSF6B不同表达组的差异。生存资料用Kaplan-Meier法和log-rank检验进行分析,进行分组因素水平间的线性趋势检验。体外实验中,细胞生长抑制率,细胞克隆数,细胞周期比例和细胞凋亡数量,使用均数±标准误(Mean±SEM)表示。对组间的差异进行检测,使用方差分析(ANOVA)和student t检验分析有无统计学意义。以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.TNFRSF6B阳性信号定位于细胞质及细胞膜。125例胶质瘤组织中,99例标本可见不同程度阳性表达,TNFRSF6B的阳性表达率为79.2%；18例正常脑组织中,2例标本可见阳性表达,TNFRSF6B的阳性表达率为11.1%。胶质瘤中TNFRSF6B的阳性表达强度率明显高于正常组织(Z=-4.661,P<0.001,Mann-Whitney U检验),表达率明显也明显高于正常组织(χ2=24.343,P<0.001,卡方检验)。TNFRSF6B表达随着胶质瘤病理分级的升高而增高, 其中强阳性(+++)仅见于Ⅲ-Ⅳ级胶质瘤病例,1～Ⅱ级与Ⅲ-Ⅳ级间TNFRSF6B差异有统计学意义(χ2=36.082,P<0.001)。其中低分级组(Ⅰ-Ⅱ级)阳性率为55.1%(27/49),高分级组(Ⅲ-Ⅳ级)阳性率为94.7%(72/76)。采用Spearman等级相关法分析显示,TNFRSF6B蛋白表达水平与病理分级呈正相关(rs=0.614,P<0.01)。但TNFRSF6B表达与性别及年龄无明显相关,P>0.05。2.正常脑组织中Ki-67标记指数(labeling index,LI)为0.08±0.04,明显低于胶质瘤组织的12.47±1.16(t=10.71,P<0.001)；正常脑组织中PCNA LI为0.03±0.02,明显低于胶质瘤组织的10.86±1.01(t=10.69,P<0.001)。胶质瘤组织中Ki-6 7 LI为12.47±1.16,明显高于PCNA LI的10.86±1.01(t=5.985,P<0.001)。Ki-67与PCNA LI呈正相关(rs=0.978,P<0.01)。Ki-67及PCNALI随胶质瘤病理分级的增高而增高。Ki-67 LI与病理分级呈正相关(rs=0.851,P<0.01)； 同样,PCNA LI与病理分级也呈正相关(rs=0.851,P<0.01)。Ki-67和PCNA LI与性别、年龄均无关。TNFRSF6B阴性组Ki-67 LI表达量为3.29±1.04,明显低于TNFRSF6B阳性组的15.09±1.34(t=6.96,P<0.001)：TNFRSF6B阴性组PCNA LI表达量为2.78±0.89,也明显低于TNFRSF6B阳性组的13.17±1.17 (t=7. 06,P<0.001).Ki-67 LI与TNFRSF6B表达呈正相关(rs=0.459,P<0.01)；PCNA LI与TNFRSF6B表达亦呈正相关(rs=0.477,P<0.01)。3.GFAP蛋白表达与胶质瘤病理分级呈负相关(rs=0.632,P<0.01)。正常脑GFAP蛋白表达率为100.0%,与Ⅰ-Ⅱ级(81.6%)和Ⅲ-Ⅳ级(39.70%)比较差异均有统计学意义(P<0.01)。Ⅰ-Ⅱ级与Ⅲ-Ⅳ级之间GFAP蛋白表达率比较差异有统计学意义(P<0.01),其中Ⅳ级的表达率最低,为25.0%。TNFRSF6B与GFAP蛋白表达呈负相关(rs=-0.397,P<0.01)。GFAP的蛋白表达与Ki-67(rs=-0.465, P<0.01)及PCNA LI (rs=-0.483, P<0.01)均呈负相关。4.本研究中76例患者具有完整生存期资料。Ki-67与PCNA的表达与生存期密切相关,证明该生存期资料的可靠性。检测76例TNFRSF6B表达与患者生存期的关系发现TNFRSF6B阴性组生存期为50±1.79个月,略高于TNFRSF6B阳性组的47.45±±3.11个月,但其差异无统计学意义(P>0.05)。5.使用MTS法测定抗TNFRSF6B中和性抗体的细胞增殖抑制效果结果显示,在加入无关抗体hIgGl处理的所有3种胶质瘤细胞系中细胞增殖没有受到任何影响。但用TNFRSF6B中和性抗体处理胶质瘤细胞,在分别培养48,72和96小时后,三种细胞系细胞增殖大大降低,最低存活率发生在96小时。在3个细胞系中,TNFRSF6B中和性抗体对U251MG细胞的增殖影响最大,在处理培养96小时后细胞增殖率为70.667±5.033%。为了证实这些结果,我们通过使用fluorimetric detection of resorufin活性测定和Hoechst33342/PI双荧光染色质染色来验证TNFRSF6B中和性抗体对胶质瘤细胞活力的影响,结果与MTS法类似,TNFRSF6B中和性抗体的细胞生长抑制作用对神经胶质瘤细胞具有时间和浓度依赖性。此外,在神经胶质瘤U251MG细胞软琼脂克隆形成试验中,用TNFRSF6B中和性抗体处理组,克隆形成率为12.333±4.933%,明显低于空白组31.333±3.055%,及hIgGl组(30.667±4.726%,P<0.001)。使用FCM检测发现,TNFRSF6B中和性抗体处理后的胶质瘤细胞,细胞周期停滞在G1/S期,这表明TNFRSF6B中和性抗体是通过抑制DNA合成从而阻滞细胞的生长。TNFRSF6B中和性抗体抑制DNA合成,增加U251MG细胞在G0-G1期的百分比。TNFRSF6B中和性抗体处理后96小时,TNFRSF6B中和性抗体组的G0-G1期细胞的百分比为59.333±1.528%,明显高于空白对照组(49.667±2.082%),及无关抗体hIgGl组(50.667±1.528%,P<0.01)。同时S期细胞百分比下降,TNFRSF6B中和性抗体组的S期细胞的百分比为20.667±0.577%,明显低于空白对照组(34.667±1.155%),以及无关抗体hIgGl组(35.667±3.055%,P<0.01)。另外两种细胞系的LN-308和U87MG中,TNFRSF6B中和性抗体对细胞周期也有类似影响,但影响稍弱。6.使用TNFRSF6B中和性抗体处理后,caspase-3/7的活性在测试的所有3种神经胶质瘤细胞系凋亡都明显增强,并表现出时间和剂量依赖性。该结果与细胞生长试验结果相吻合,TNFRSF6B中和性抗体对caspase-3/7活性的影响最显著的是U251MG细胞,最适浓度为0.8mg/L,活性最高时间点是TNFRSF6B中和性抗体处理后96小时。同时使用Hoechst33342/PI双荧光染色实验发现,TNFRSF6B中和性抗体处理组的凋亡明显增加,结果与caspase-3/7活性检测相符。7.最后,我们通过使用免疫印迹检查了与细胞存活增殖,凋亡,侵袭和转移相关的MMP-2,ERK1/2和AKT的表达量。无关抗体higGl对这些通路的影响不大。但MMP-2,磷酸化ERK1/2和磷酸化-AKT的表达量在经过TNFRSF6B中和性抗体处理96小时后下降明显。结论1.TNFRSF6B与胶质瘤的病理分级及GFAP表达、细胞增殖状态有关,提示在胶质瘤的发生,发展过程中,TNFRSF6B的异常表达发挥重要的作用。2.TNFRSF6B的高表达可能在胶质瘤的生长增殖及凋亡中发挥重要的作用。3.抑制TNFRSF6B的表达可诱发胶质瘤细胞出现凋亡,从而降低了细胞增殖速度。4.TNFRSF6B中和性抗体有望为胶质瘤分子靶向治疗提供新的选择。