三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)广泛分布于太平洋西部海岸的温带地区,是东亚各国重要的海洋渔业资源,也是中国重要的养殖对象。在过去的十年中,中国三疣梭子蟹养殖业发展迅速,2014年其总产量已达到118836吨。然而,由于三疣梭子蟹养殖规模的迅速扩大以及繁殖调控技术的缺乏,优质的三疣梭子蟹的产量已不能满足日益增长的需求。繁殖调控技术的缺乏已经成为制约该产业可持续发展的关键问题。近年来,三疣梭子蟹的繁殖调控机制的研究越来越受到人们的重视。性腺是生物体进行有性生殖产生配子的主要器官,有众多调节因子参与了配子发生过程的调控。目前,甲壳类性腺发育和配子发生过程调控机制的研究主要集中在转录水平,转录后水平的研究较少。miRNAs作为一类重要的转录后调节因子,其在性腺发育过程的功能得到了广泛的关注。本研究分析了三疣梭子蟹繁殖相关miRNA及其合成通路的重要基因在性腺发育过程的功能,主要研究结果如下:1.MiRNA合成通路相关基因在三疣梭子蟹性腺发育过程中的表达分析已知,Drosha、Exportin 5、Dicer 1和Argonaute 1(AGO 1)基因是miRNA合成通路的重要基因,而Dicer 2和Argonaute 2(AGO 2)则主要参与siRNA的合成调控。为研究上述基因在三疣梭子蟹性腺发育过程中的功能作用,本实验利用RACE技术克隆了上述基因的cDNA全长序列,同时进行序列分析、同源分析和进化树分析发现,Drosha、Dicer 1和AGO 1在进化上高度保守,与各自亲缘关系较近的物种的蛋白质序列相似度普遍较高(83%-99%),而Exportin 5、Dicer 2和AGO 2则保守性较低(序列相似度44%-51%)。对三疣梭子蟹Drosha、Exportin 5、Dicer 1、Dicer 2、ADO 1和ADO 2基因进行组织差异性表达分析,结果显示上述基因在各种组织中均表达,且多种在肝胰腺或卵巢中高表达,其次为精巢等。对各基因在精巢发育不同时期的表达分析发现,Drosha、Exportin 5、Dicer 1和AGO 1基因的表达量均在II期达到最高,且各基因在不同时期表达变化趋势基本一致。Dicer 2和AGO 2均在I期高表达(P<0.05),其他时期差异不大。在卵巢发育不同时期,Drosha与Exportin 5基因在卵巢发育不同时期表达量变化趋势大致相同,都是随着卵巢发育(从II期到V期)逐渐升高,在V期达到最大值(P<0.05)。Dicer 1与AGO 1在各时期表达量变化趋势也基本一致,从I期到III期表达量变化不大,IV期迅速上调,V期达到峰值,VI期又迅速下调。Dicer 2与AGO 2在各时期表达变化趋势也基本一致,都是在II期和V期显著高于其他时期(P<0.05)。因此,我们推测Drosha、Exportin 5、Dicer 1、Dicer 2、AGO 1和AGO 2基因均参与了三疣梭子蟹性腺发育的调控,同时暗示miRNAs和siRNA可能在相应时期发挥重要作用。2.三疣梭子蟹精巢和卵巢miRNA的鉴定与比较分析为研究miRNAs在三疣梭子蟹性腺发育过程中的功能作用,对三疣梭子蟹性腺相关miRNAs进行鉴定和分析。利用Illumina测序技术,在卵巢和精巢中共识别了188个已知的和65个新的miRNAs。其中多个miRNA,如let-7、let-7c、let-7f,mir-2,mir-184和mir-276,在卵巢和精巢组织中均大量表达,暗示其在性腺发育和功能发挥过程中的重要作用。表达分析发现,75个miRNA在卵巢和精巢之间差异表达。同时KEGG分析发现,这些miRNAs的靶基因显著富集于几种与繁殖相关的信号转导通路,如促性腺激素释放激素信号通路,卵巢的类固醇和Wnt信号通路。进一步的miRNA表达分析表明,某些miRNA在卵巢(mir-9,mir-125和mir-27a)和精巢(mir-7,mir-87和mir-2788)发育过程中的表达方式具有阶段特异性。暗示它们在三疣梭子蟹性腺发育不同时期发挥不同的功能。本研究结果将为甲壳类繁殖相关miRNA介导的转录后基因调控的进一步研究提供重要参考。