第一部分:SGLT2抑制剂恩格列净通过代谢重编程调节免疫性血小板减少症中的CD4+T细胞分化研究背景:免疫性血小板减少症（Immune thrombocytopenia,ITP）是一种获得性自身免疫性疾病,其特点是由于免疫介导的血小板破坏和血小板产生受损而导致血小板计数降低。ITP的发病机制复杂且异质性强,多种机制被认为参与其中。其中,细胞免疫常被认为是发病机制的关键,T细胞失调和T细胞相关的细胞因子异常参与了 ITP的发病机制。ITP是一种T辅助性（T helper）1细胞和Th17细胞过度极化的疾病,其分泌的细胞因子IFN-γ和IL-17增加,抑制性T亚群调节性T细胞（Regulatory cells,Tregs）减少,导致对自身抗原的耐受性丧失。越来越多的证据表明,T细胞功能与代谢息息相关。T细胞活化高度依赖于糖酵解,即使是在氧供正常状态下。不同T细胞亚群具有不同的代谢特征。T辅助细胞（Th1和Th17）依赖于有氧糖酵解,而Tregs依赖于氧化磷酸化（oxidative phosphorylation,OXPHOS）。既往研究表明,代谢重编程参与类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）等自身免疫性疾病的病理机制。如今,代谢重编程正成为自身免疫性疾病的新靶点。然而,在ITP中,CD4+T细胞的代谢,特别是来自不同亚群的代谢尚未被研究。恩格列净是一种钠-葡萄糖共转运蛋白2（sodium-glucose cotransporter 2,SGLT2）抑制剂,通过抑制肾脏葡萄糖的再吸收而被开发为一种抗糖尿病药物。近年来,SGLT2抑制剂除了降血糖外,还因其在在心脏和肾脏的抗炎作用备受关注。研究发现,恩格列净可以下调心肌细胞和巨噬细胞脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide Synthase,iNOS）的表达。恩格列净在心血管系统中的的免疫调节作用还包括通过AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase）激活促进巨噬细胞向旁路激活巨噬细胞（M2）极化。然而,SGLT2抑制剂对T细胞的作用尚不明确。在本研究中,我们发现在ITP中,CD4+T细胞代谢重编程导致CD4+T细胞群体失衡,Th1细胞和Th17细胞增多,Tregs细胞减少。SGLT2抑制剂恩格列净通过恢复代谢平衡调节CD4+T亚群分化,抑制Th1细胞和Th17细胞比例,增加Tregs细胞比例。研究目的:（1）探究ITP患者CD4+T细胞代谢特征,探究恩格列净对CD4+T亚群分化影响。（2）阐述恩格列净通过代谢重编程影响CD4+T细胞分化作用及在主动型ITP模型中作用的证实。研究方法:（1）样本收集:收录ITP患者和健康对照,取其外周血,分选CD4+T细胞,体外细胞培养,用于做流式细胞分析、Seahorse能量分析、RT-PCR、蛋白质免疫印迹等实验。（2）Seahorse能量代谢实验:糖酵解压力实验和线粒体压力实验用于检测ITP和健康对照CD4+T细胞以及检测ITP患者CD4+T细胞给予恩格列净处理后的氧化磷酸化和糖酵解水平。（3）流式细胞术:用于检测CD4+T亚群细胞,Th1细胞、Th17细胞以及Tregs比例。（4）RT-PCR:用于检测糖酵解相关基因Glut1、HK2、PFKB1、PKM2的mRNA水平。（5）蛋白免疫印迹法:用于检测mTOR相关信号通路蛋白mTOR、PI3K的蛋白水平。（6）主动型ITP小鼠模型构建:用于验证药物在ITP模型中的作用,观察恩格列净药物处理后对主动型ITP小鼠模型血小板数目恢复情况及小鼠脾脏的CD4+T亚群变化。研究结果:（1）ITP患者的CD4+T细胞发生了代谢重编程糖酵解压力实验和线粒体压力实验显示:与健康对照组相比,ITP患者的CD4+T细胞糖酵解水平明显上调,而氧化磷酸化水平明显下降。ITP患者的CD4+T细胞发生了从氧化磷酸化到糖酵解的代谢重编程。（2）SGLT2抑制剂恩格列净可以调控CD4+T亚群分化体外细胞培养显示恩格列净可以抑制Th1、Th17比例,上调Tregs比例。（3）恩格列净通过影响代谢重编程调节CD4+T亚群分化恩格列净可以逆转ITP患者的CD4+T细胞代谢异常,促进氧化磷酸化,抑制糖酵解。RT-PCR结果显示恩格列净可以抑制糖酵解相关基因mRNA水平。（4）恩格列净抑制mTOR信号通路来发挥代谢调节作用mTOR激动剂可中和恩格列净的作用。Western blot结果显示恩格列净可以抑制mTOR和PI3K的磷酸化。（5）恩格列净可改善主动型ITP小鼠模型的血小板减少,恩格列净减轻主动型ITP小鼠模型中血小板数目下降程度并使血小板水平提前恢复正常,使ITP小鼠脾脏中失衡的T亚群细胞比例恢复正常。恩格列净组的血小板计数在最低期显示出较高水平,血小板恢复比对照组快,恩格列净可以使主动型ITP小鼠脾脏中T细胞比例发生变化,下调Th1、Th17比例,上调Tregs比例。结论:（1）首次证实了 ITP患者的CD4+T细胞发生了从氧化磷酸化转移到糖酵解的代谢重编程,这种代谢重编程影响了 T细胞亚群比例变化。（2）首次证实了 SGLT2抑制剂恩格列净可以通过代谢重编程,调节CD4+T细胞分化,抑制Th1和Th17细胞比例,同时增加Tregs的比例。（3）恩格列净对于主动型ITP小鼠有治疗作用,有望成为治疗ITP的潜在药物。第二部分:苦味受体在ITP患者中CD4+T细胞分化的探索研究背景:免疫性血小板减少症（Immune thrombocytopenia,ITP）是一种以血小板数目减少和自发皮肤黏膜出血为主要特征的自身免疫性疾病。研究表明,ITP发病机制是多因素多环节参与的。主要发病机制为自身血小板抗原免疫失耐受导致的血小板破坏增加和/或血小板生成不足。此外,T细胞介导的免疫异常也是ITP发病机制的重要环节。Panitsas等人发现,成人ITP的发病机制以细胞免疫的复杂失调为中心,包括向Th1细胞和Th17细胞的优势转移,Th2细胞和Tregs的比例下降,Th1/2比例升高和Th17/Tregs升高等。T亚群比例失衡和功能缺陷导致了免疫失耐受,继而细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTLs）破坏血小板。苦味受体（bittertastereceptors,TAS2Rs或T2Rs）是与苦味感知传导和表达密切相关的细胞表面受体,最早于2000年在味蕾的味觉细胞中发现。苦味的感知是机体有效的自我保护机制之一,可以防止摄入有害物质。苦味受体属于G蛋白偶联受体超家族,在人类中,TAS2Rs属于具有25个功能成员的家族,聚集在第5、7和12染色体上。越来越多的证据表明TAS2Rs在味觉系统以外的器官中表达,包括胃肠道、甲状腺、呼吸器官、肾脏、中枢神经系统和皮肤等。除了苦味感知外,苦味受体在不同的细胞中发挥不同的功能,如固有免疫、肌肉收缩和分泌以及再生等。目前苦味受体在免疫方面的研究多集中在固有免疫方面,而苦味受体在适应性免疫方面的报道极少。Agne Malki,Julia等于2015年首次发现在血液细胞,包括自然杀伤细胞（naturalkillercells,NK）细胞、单核细胞、淋巴细胞中存在苦味受体;Hoai T.T.Tran 等于 2018 年报道了 T2R38（bittertastereceptor member38）在T细胞活化后比静息期T细胞表达升高,但是苦味受体在T细胞分化方面的研究未见报道。为了探索苦味受体在T细胞分化中的功能,我们以ITP疾病为对象,研究了苦味受体在ITP患者CD4+T细胞中的免疫调节作用,并探索其机制。在这项研究中,我们探究了苦味受体在T细胞分化过程中的作用及机制,通过筛选,我们发现T2R14阻断剂可以调节CD4+T细胞亚群分化,与健康对照者相比,ITP患者的CD4+T细胞中T2R14表达升高,其调节分化作用与调节细胞代谢相关。在此,我们证明了 T2R14在ITP患者CD4+T细胞中的免疫调节作用。研究方法:（1）细胞培养:在ITP患者的CD4+T细胞体外诱导实验中,用不同苦味受体阻断剂处理,筛选出可能对T细胞分化有作用的苦味受体。（2）钙离子检测:评估T2R14激动剂和阻断剂是否作用于苦味受体。（3）流式细胞术:比较ITP患者和健康对照的T2R14和T2R39表达水平;检测CD4+T亚群细胞,Th1、Th2、Th17比例;检测不同Th亚群中T2R14表达水平。（4）siRNA-T2R14转染:进一步验证T2R14的免疫调节作用,排除T2R39的影响。（5）Seahorse能量代谢实验:糖酵解压力实验和线粒体压力实验用于检测苦味受体抑制剂和激动剂对代谢的影响。（6）RT-PCR:用于检测ITP患者和健康对照组的T2R14和T2R39的mRNA水平;T2R14阻断剂和激动剂处理后糖酵解相关基因Glut1、HK2、PFKB1、PKM1以及mTOR不同亚基的mRNA水平。研究结果:（1）用苦味受体阻断剂筛选后,发现6甲氧基黄烷酮（6-Methoxyflavanone,6-MeOF）-T2R14和T2R39阻断剂可以抑制Th1细胞和Th17细胞比例,升高Th2细胞比例。（2）钙离子检测证实了 T2R14激动剂和阻断剂作用于苦味受体发挥作用。（3）流式检测比较ITP患者和健康对照T2R14和T2R39表达水平差异,发现T2R14在ITP患者的CD4+T细胞表达显著高于健康对照组,有统计学差异,T2R39在ITP组的表达也升高,但未达统计学差异;用T2R14激动剂和T2R14阻断剂体外培养T细胞,发现T2R14激动剂和T2R14阻断剂对CD4+T细胞分化作用相反:T2R14阻断剂抑制Th1细胞和Th17细胞比例,上调Th2细胞比例,T2R14激动剂上调Th1和Th17细胞比例,下调Th2细胞比例;T2R14在不同Th亚群的表达:Th2细胞表达最高,其次为Th17细胞,Th1细胞表达最低。（4）siRNA-T2R14转染:与T2R14阻断剂对T细胞亚群分化的调节作用一致,抑制Th 1和Th17细胞比例,上调Th2细胞比例。（5）通过代谢实验发现,T2R14可以调节代谢,其激动剂可以上调CD4+T细胞的糖酵解和氧化磷酸化水平,阻断剂则下调糖酵解和氧化磷酸化水平,综合效应以影响糖酵解为主。（6）RT-PCR结果发现,在CD4+T细胞中,ITP患者比健康对照组的TAS2R14的mRNA表达水平升高;T2R14激动剂和阻断剂影响糖酵解相关基因mRNA水平,对mTOR两个亚基作用相反:T2R14阻断剂抑制Raptor的mRNA水平,升高Rictor的mRNA水平,T2R14激动剂升高Raptor的mRNA水平,降低Rictor的mRNA水平。结论:（1）T2R14阻断剂可以调节ITP患者的CD4+T细胞分化,下调Th1和Th17比例,上调Th2比例。（2）T2R14在ITP患者的CD4+T细胞表达升高。（3）T2R14通过调节代谢发挥对CD4+T细胞的调节作用,以影响糖酵解为主。（4）T2R14通过对mTOR的两个亚基作用不同发挥免疫调节作用。第三部分:苦味受体激动剂苯甲地那胺在小鼠造血干细胞移植后造血重建中的作用及研究研究背景:在造血系统中,造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSCs）位于造血层的顶端,具有自我更新和多向分化的能力,对于干细胞库的终生维持和所有类型血细胞的产生都是必不可少的。大多数造血干细胞在骨髓内的壁龛中处于静止状态,这一过程受到严格调控,以维持血液中白细胞、血小板和红细胞的稳定数量。单个造血干细胞经历了几种命运之一:静止、凋亡、循环以自我更新,或产生多能祖细胞（multipotentprogenitors,MPPs）,或迁移。这些命运在由多种内在及外在因素共同调控。当特定的局部微环境（niche）改变导致造血干细胞库的平衡被破坏后,造血干细胞就会对刺激做出反应。造血干细胞移植是目前治疗造血系统恶性肿瘤最有效的治疗方法,造血干细胞的有效归巢决定了移植后造血功能的成功恢复。干细胞在骨髓内归巢至特定龛位是一个快速和协调的过程,该过程受到严格调节,各种粘附性分子、趋化因子、糖蛋白、整合素,都参与了造血干细胞移植后的归巢。苦味受体（bitter taste receptor,TAS2Rs/T2Rs）属于G蛋白耦联受体（G protein-coupled receptors,GPCR）家族,在人类有25个不同成员,在小鼠有36个成员。T2Rs最初发现于口腔,负责感知苦的味道,近年来,越来越多的报道发现,其在口腔外的组织器官中广泛表达。苦味受体的功能也越来越多的被发现,包括肌肉收缩,分泌,再生等。我们在第二部分已经研究了苦味受体在T细胞免疫调节中的作用。2020年有研究报道,急性骨髓性白血病细胞表达T2Rs亚型,并参与调节白血病细胞的生物学功能,然而,苦味受体在正常造血与移植后造血重建方面的研究未见报道。苯甲地那胺（Denatonium benzoate,DB）是目前己知的最苦的物质之一,已被广泛证明是一种苦味激动剂,可用于激活许多不同细胞类型的苦味受体,但是其在造血方面未见报道,本研究将以苯甲地那胺做为苦味受体激动剂来首次研究苦味受体在骨髓移植（bone marrow transplantation,BMT）小鼠造血重建中的作用。研究方法:（1）本研究使用了同基因骨髓移植模型来研究苦味受体激动剂苯甲地那胺在致死辐照小鼠骨髓移植后造血重建中的研究。（2）RT-PCR:用于验证苦味受体相关基因mRNA水平。（3）钙离子检测:用于分析苯甲地那胺是否能激活苦味受体,引起钙离子升高。（4）血细胞计数:用于评估苯甲地那胺处理后对BMT小鼠血细胞水平恢复情况的影响。（5）通过流式细胞检测,评估BMT小鼠造血干细胞各阶段比例及谱系变化,和终末分化的影响。（6）小鼠造血干细胞集落形成实验（Colony-Forming Unit,CFU）,反映苯甲地那胺处理后造血干祖细胞向多个谱系分化的增殖分化能力。（7）周期检测:用于检测BMT小鼠苯甲地那胺处理后对骨髓LSK细胞周期比例的影响。结果:（1）RT-PCR检测并证明了骨髓细胞存在苦味受体,DB处理后,苦味受体亚型的mRNA表达升高。（2）钙离子检测证实了T2R激动剂DB刺激骨髓单个核细胞后,诱发细胞内Ca2+浓度增加,从而证明其激活T2R的功能。（3）血细胞计数证实DB促进致死辐照小鼠骨髓移植后血细胞水平恢复。（4）流式细胞术结果证实DB提高了BMT小鼠骨髓的造血干祖细胞比例。（5）小鼠造血干细胞集落形成实验发现DB利于造血祖细胞的增殖分化。（6）周期检测显示DB促进BMT小鼠造血干细胞进入增殖周期,G0期比例下降。结论:我们的研究首次将苦味受体的研究范围扩大到了造血领域,并阐明了 T2Rs在造血干细胞分化的功能及在造血干细胞移植中的调节作用。苦味受体激动剂苯甲地那胺可以促进造血干细胞向各谱系祖细胞的分化,利于骨髓移植后的造血恢复。