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CXC Chemokine Receptor 3——CXCR3(CD183)是一种七次跨膜的G-蛋白偶联受体,目前已发现三种剪接变体,分别为CXCR3-A(即通常所说的CXCR3)、CXCR3-B及CXCR3-alt。CXCR3A主要表达于活化/记忆T细胞、NK细胞及巨噬细胞,其配体为CXCL9/Mig、CXCL10/IP-10及CXCL11/I-TAC。近年研究发现,CXCR3A在一些恶性肿瘤细胞表面高表达,通过受体-配体相互作用介导肿瘤的转移和侵袭。CXCR3B主要表达于内皮细胞,除了可与CXCL9/Mig、CXCL10/IP-10及CXCL11/I-TAC结合,其还是CXCL4/PF4的功能性受体。配体与血管内皮细胞表面的CXCR3B结合可诱导细胞凋亡,在维持血管稳定方面具有重要作用。本研究旨在克隆小鼠CXCR3A基因并将其转入不表达该分子的小鼠黑色素瘤细胞B16中,在体内外研究B16-mCXCR3A细胞的迁移能力和致瘤性。同时克隆人CXCR3B基因,并建立稳定表达人CXCR3B分子的基因转染细胞株L929-huCXCR3B,为制备相应的单克隆抗体奠定了物质基础。第一部分小鼠CXCR3A基因的克隆及基因转染细胞株B16-mCXCR3A的构建【目的】克隆小鼠CXCR3A基因并构建稳定表达该分子的基因转染细胞株B16-mCXCR3A。【方法】采用PCR方法从pMD19-T/mCXCR3A质粒中扩增小鼠CXCR3A基因,插入到真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染小鼠黑色素瘤细胞B16;G418加压筛选阳性克隆,分别用RT-PCR方法与免疫荧光技术分析阳性克隆中CXCR3A在mRNA和蛋白水平的表达。【结果】构建了表达小鼠CXCR3A基因的真核表达载体pIRES2-EGFP/mCXCR3A,转染该载体后获得了稳定表达小鼠CXCR3A的B16-mCXCR3A细胞。【结论】构建了稳定表达小鼠CXCR3A基因的基因转染细胞株B16-mCXCR3A,此为进一步体内外研究奠定了基础。第二部分B16-mCXCR3A细胞体外迁移及体内对肿瘤形成与转移的影响【目的】用已构建的基因转染细胞株B16-mCXCR3A研究小鼠CXCR3A分子在肿瘤形成及转移过程中的作用。【方法】采用Transwell系统检测B16-mCXCR3A细胞在其配体IP-10介导下的迁移能力。将B16-mCXCR3A细胞分别通过皮下和眼静脉注射接种于BALB/c小鼠,观察在小鼠体内的成瘤率及肿瘤转移情况。【结果】在20μg/L小鼠IP-10的作用下,B16-mCXCR3A细胞(1×105个)迁移的细胞数为3208个,与B16组和B16-mock组相比均具有统计学意义(P<0.01)。于小鼠皮下接种B16-mCXCR3A细胞、B16细胞和B16-mock细胞,第20天成瘤率均为100%。于小鼠眼静脉注射B16-mCXCR3A细胞,第21天时50%的小鼠在肺部出现肉眼可见的黑色肿瘤转移灶,B16细胞组和B16-mock细胞组肺部未见肿瘤转移灶,B16-mCXCR3A组与B16组和B16-mock组相比均具有统计学意义(P<0.01)。【结论】转染小鼠CXCR3A基因的B16-mCXCR3A细胞,在小鼠IP-10介导下可定向迁移,并可促进肿瘤的转移。第三部分人CXCR3B基因转染细胞株的构建、鉴定及生物学功能初步研究【目的】克隆人CXCR3B基因,并构建含有该目的基因的真核表达载体,获得稳定表达人CXCR3B分子的基因转染细胞株L929-huCXCR3B。【方法】采用PCR方法从pMD19-T/huCXCR3A质粒中扩增人CXCR3B基因,通过双酶切装入到真核表达载体pIRES2-EGFP中;脂质体法转染L929细胞,G418加压筛选阳性克隆;分别用RT-PCR方法与免疫荧光技术分析阳性克隆中人CXCR3B在mRNA和蛋白水平的表达。MTT分析基因转染细胞株L929-huCXCR3B在其配体Mig作用下的增殖能力。【结果】成功克隆了人CXCR3B基因并构建了表达该分子的真核表达载体pIRES2-EGFP/huCXCR3B,并获得了稳定表达人CXCR3B的L929-huCXCR3B细胞,膜表面人CXCR3B分子的阳性表达率为93%。该基因转染细胞与Mig共培养24、48及72h,抑制率分别为41.44%、44.01%和24.80%。【结论】构建了稳定表达人CXCR3B基因的基因转染细胞株L929-huCXCR3BB,此为研究CXCR3B信号转导及生物学功能与制备相应的单克隆抗体奠定了基础。