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背景:作为糖尿病(diabetes mellitus,DM)最为重要的并发症,糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是全球范围内导致终末期肾功能衰竭最为重要的原因之一,并已成为愈发严重的人类社会健康问题。因此尽早明确DN的发病机制、研究如何延缓DN的进展并积极寻求有效的治疗方法对全人类的健康具有极为重要的意义。近些年人们对于DN的发病机制更多着眼于细胞和分子水平,这也使人们逐渐意识到炎症反应在DN发病机制中有着极为重要的作用。在诸多炎症因子中,白介素-6(interleukin-6,IL-6)的作用越来越被人们所关注。目前人们已经发现IL-6在DN中的过表达与肾小球肥大及尿蛋白的排泄有关,并可通过多种机制加速DN进展。然而,对于影响DN肾小球内IL-6表达的因素及具体途径,目前尚无可靠而详尽的报道。研究表明在高糖刺激的细胞或动物模型中,12-脂氧化酶(12-lipoxygenase,12-LO)的作用产物12(S)-氢氧化二十碳四烯酸[12(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid,12(S)-HETE]的水平明显增高,且12(S)-HETE可与血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-?)发生相互作用而共同影响DN进展。联想到我们已经认识到的IL-6在DN中的作用,我们设想在1型或2型DM中,12(S)-HETE可能也会通过上调IL-6的表达而加速DN的进展。人们发现,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族中的p38MAPK作为细胞信号转导通路的交汇点,在DN中可被多种因子激活而发挥多种生物学效应。近年越来越多的研究表明,无论在DN的发病早期还是发展阶段,p38MAPK均发挥了重要作用,并可以通过调节多种转录调节因子、蛋白质以及酶的活性,在胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)发病机制中起到重要作用。因此,研究p38MAPK在DN发病机制中的作用已越来越受到人们关注。然而,在12(S)-HETE影响IL-6表达的过程中,p38MAPK信号通路是否作为重要的中间环节起到中介作用,目前尚无相关报道。近年来有越来越多的证据指出基因多态性在决定DN易感性方面的重要作用。自从Fishman等发现IL-6基因-174G>C多态性可以影响IL-6基因的转录与血清水平后,IL-6基因多态性便开始成为人们研究的热点。由于IL-6基因-174G>C和-634C>G有重要的功能,因此是被研究的最多的2个单核苷酸多态性。然而目前不同的研究对于上述两个基因多态性与DN易感性的关系所得的结论并不完全相同,因此IL-6基因多态性是否影响了DN易感性的问题仍未解决。综上,本研究主要提出两点设想:第一,12(S)-HETE通过活化p38MAPK通路上调IL-6的表达,进而加速DN进展;抑制12(S)-HETE-p38MAPK途径可延缓DN进展。第二,IL-6基因多态性与DN易感性有关。方法:(1)应用浓度为10-7mol/L的12(S)-HETE直接刺激大鼠系膜细胞(rat mesangial cell,RMC),分别于刺激0h、1h、2h、4h、6h、24h后收集细胞,测IL-6的表达。(2)将原代培养的小鼠系膜细胞(mice mesangial cell,MMC)分为两组:野生型MMC组(WT组)和12-LO基因敲除MMC组(LOKO组),分别测定两组MMC中的IL-6的表达。(3)将转基因小鼠来源的MMC分为两组:高表达12-LO组(pc DNA/12-LO)和正常表达12-LO的对照组(pc DNA),分别测两组MMC中的IL-6的表达。(4)将原代培养的RMC分为3组:正常对照组,12(S)-HETE处理组和12(S)-HETE+SB203580处理组(SB203580为p38MAPK的抑制剂,浓度为1μmol/L,于给予12(S)-HETE前30分钟加入)。24h后测三组RMC中IL-6的表达及p-p38MAPK水平。(5)将大鼠分为两组:12(S)-HETE处理组(用微量渗透泵持续泵入12(S)-HETE,1 mg·kg-1·d-1)和对照组,7天后处死大鼠,测肾小球内p-p38MAPK、p-ERK、p-JNK水平及IL-6含量。(6)采用一次性腹腔注射大剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)法诱导1型DM模型,造模成功后将DM小鼠分为4组:野生型对照组(WT);12-LO基因敲除组(LOKO);野生型糖尿病组(WT+STZ);12-LO基因敲除糖尿病组(LOKO+STZ)。于实验结束前测血糖、体重、24小时尿白蛋白,处死大鼠后右肾称重、提取肾脏分离肾小球,检测肾小球内IL-6水平。(7)采用高脂饮食结合小剂量STZ腹腔注射的方法诱导2型DM大鼠模型,造模成功后将DM大鼠随机分为2组:2型DM组和2型DM+CDC(cinnamyl-3,4-dihydroxy-α-cynanocinnamate,12-LO抑制剂)组(CDC为12-LO抑制剂,经皮下注射,8 mg·kg-1·d-1,3次/周),以标准饲料喂养大鼠作为对照组。8周后测血糖、体重、24小时尿白蛋白,处死大鼠后右肾称重、提取肾脏分离肾小球,观察肾脏病理结构并检测肾小球内IL-6及p-p38MAPK水平。(8)应用Meta分析方法,通过计算合并的比值比和95%置信区间来评估IL-6基因多态性与DN易感性的关系,并根据尿白蛋白排泄率,通过将病人分为3组(大量蛋白尿组,微量蛋白尿组和正常蛋白尿组)来进行亚组分析。采用系列过筛法分离肾小球,过碘酸-希夫氏(periodic acid schiff,PAS)染色观察肾组织结构,酶联免疫吸附检测法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测尿白蛋白及肾小球内IL-6含量,Western blot检测p-p38MAPK、p-ERK及p-JNK水平,逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测细胞及肾小球内IL-6的表达。结果:(1)12(S)-HETE刺激1小时后,RMC中IL-6的表达明显增加(P<0.01),且可维持24小时。(2)与WT对照组相比,12-LO基因敲除组中MMC表达IL-6明显减少(P<0.01)(3)与对照组相比,高表达12-LO组中MMC表达IL-6明显增加(P<0.01)。(4)与对照组相比,12(S)-HETE处理组RMC中p38MAPK活性和IL-6的表达明显增加(P<0.01)。与12(S)-HETE处理组相比,加用SB203580抑制p38MAPK可使12(S)-HETE+SB203580组RMC中p38MAPK活性和IL-6的表达明显减少(P<0.05)。(5)与对照组相比,12(S)-HETE处理组肾小球内IL-6的表达明显增加(P<0.01)。(6)与对照组相比,12(S)-HETE处理组肾小球内p-ERK、p-JNK无明显变化。与对照组相比,12(S)-HETE处理组肾小球内p-p38MAPK水平明显增加(P<0.01)。(7)与WT组及LOKO组相比,WT+STZ组和LOKO+STZ组小鼠血糖、尿白蛋白均明显增加(P<0.01)。与WT+STZ组相比,LOKO+STZ组小鼠血糖及尿白蛋白无明显变化。(8)与WT组及LOKO组相比,WT+STZ组肾重/体重比以及IL-6的表达明显增加(P<0.01)。与WT组及LOKO组相比,LOKO+STZ组肾重/体重比以及IL-6的表达明显增加(P<0.05)。与WT+STZ组相比,LOKO+STZ组小鼠肾重/体重比以及IL-6的表达均明显下降(P<0.05)。(9)与对照组相比,2型DM组大鼠血糖、肾重/体重及24 h尿白蛋白均明显增加(P<0.01)。与2型DM组相比,加入CDC治疗8周后2型DM+CDC组血糖无明显变化,但肾重/体重比以及尿白蛋白明显下降(P<0.05)。(10)与对照组相比,2型DM组大鼠肾小球体积明显增大(P<0.01),系膜基质明显增多。经CDC治疗8周后,与2型DM组相比,2型DM+CDC组大鼠肾小球体积明显缩小(P<0.05),系膜基质增生的现象明显缓解。(11)与对照组相比,2型DM组大鼠肾小球内IL-6及p-p38MAPK水平明显增加(P<0.01)。CDC治疗8周后,2型DM+CDC组大鼠肾小球内IL-6及p-p38MAPK水平较2型DM组明显下降(P<0.05)。(12)IL-6基因-174G>C多态性与DN易感性无显著关系,IL-6基因-634C>G多态性可增加DN易感性,亚组分析结果均与整体模型的结果一致。结论:(1)12(S)-HETE可增加DN肾小球内IL-6的表达;抑制12(S)-HETE可减少DN肾小球内IL-6的表达,并能抑制肾小球肥大、延缓DN进展。(2)12(S)-HETE通过p38MAPK信号通路诱导肾小球内IL-6的表达;抑制p38MAPK可减少IL-6的表达。(3)IL-6基因-634C>G多态性能增加DN易感性;而IL-6基因-174 G>C多态性与DN易感性无显著联系。