目的本项研究采用巢式-RT-PCR法从BALB/c鼠脾组织获取免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）G Fc段编码基因,用限制性内切酶从乙脑病毒（Japaneseencephalitis virus,JEV）重组子pJME中获取prME蛋白编码基因,分别将二者插入同一真核表达载体pcDNA3.1（+）不同酶切位点间,构建重组子命名为pJME/IgG Fc,并建立稳定表达融合蛋白的CHO细胞株,为流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis,JE）DNA疫苗增强效应等方面研究奠定基础。材料与方法一、实验材料1、细胞及动物中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary,CHO）细胞购自中国科学研究院上海细胞库,生长于37℃,5%CO₂及含10%胎牛血清（Fatal calf serum,FCS）的Dulbecco’modified eagle medium（D-MEM）高糖培养液中。BALB/c鼠购自中国科学院上海实验动物中心。2、质粒及菌株含JEV prME蛋白编码基因重组质粒被命名为pJME,由本实验室构建;真核表达载体pcDNA3.1（+）购自Invitrogen公司,用于JEV prME蛋白与IgG Fc段编码基因的融合构建;大肠杆菌JM109与DH5α购自Takara公司,用于重组质粒构建、转化。3、主要试剂RNA抽提试剂（Code No.D312）,RT-PCR试剂盒（Code No.DR027A）,DNA片断纯化试剂盒（Code No.DV807）,DNA A尾试剂盒（Code No.D404）,琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒（Code No.DV805）,DNA连接试剂盒（Code No.D6023）,质粒小剂量提取试剂盒（Code No.DV801A）,限制性内切酶EcoRI、BamHI以及NotI等均购自Takara公司,用于重组质粒的构建和酶切鉴定。脂质体（Lipofectamine2000）购自Invitrogen公司,用于CHO细胞转染。新霉素类似物（G418）购自GiBCO公司,用于CHO细胞抗性克隆株的筛选。氨苄青霉素购自Sigma公司,琼脂糖购自Takara公司,用于质粒的转化和电泳分析;D-MEM高糖培养液,10%FCS,青,链霉素均购自海科隆公司,用于CHO细胞的培养;山羊抗鼠IgG-Fc购自Santa公司,FITC标记的兔抗山羊CD32购自北京中杉公司,用于重组质粒转染后的免疫荧光检测;蛋白裂解液,上样缓冲液,PVDF膜,预染蛋白Marker购自碧云天公司,辣根酶标记兔抗山羊IgG购自北京中杉公司,均用于Western-blot分析。二、实验方法1、JEV prME蛋白与鼠IgG Fc段编码基因的重组构建从BALB/c鼠脾组织提取总RNA,巢式-RT-PCR方法扩增,经修饰后形成IgG Fc段编码基因片段,将其构建于测序载体pMD19-T simple EcoRI/NotI酶切位点,采用ABIPRSM^TM310Genetic Analyzer（Pekin-Elmer/Applied）及引物Bca BEST PrimerRV-M对重组质粒进行测序分析,并与Genebank公布的IgG Fc CDS区域序列相比较。反转录引物及3’末端外引物:5’GGT GGA GGT AGG TGT CAG AG 3’,互补于IgG Fc CDS区域第1491～1510核苷酸（nucleotide,nt）位点;3’末端内引物:5’GCG GCC GCT TTA CCA GGA GAG TGG GAG AG 3’,互补于IgG Fc CDS区域第1432～1460nt位点。5’末端外引物:5’AGC GAG ACC GTC ACC TGC AA3’,符合于IgG Fc CDS区域第709～728nt位点;5’末端内引物:5’GAA TTCGGT GGA GGC GGT TCA GGT GGA GGT GGT TCA GGA GGA GGT GGA TCGATG GTG CCC AGG GAT TGT GGT TGT AAG 3’,符合于IgG Fc CDS区域第718～795nt位点。限制性内切酶EcoRI（-GAA TTC-）合成于5’末端,NotI（-GCGGCC GC-）合成于3’末端。将EcoRI/NotI酶消化的RT-PCR产物插于真核表达载体pcDNA3.1（+）EcoRI/NotI酶切位点之间,此重组质粒命名为pcDNA3.1（+）/IgG Fc。将其热转化至大肠杆菌DH5α中并经LB琼脂（ampicillin,100mg/L,Sigma）培养筛选出阳性菌落,接种于3mL LB培养液中,小剂量提取试剂盒提取质粒。EcoRI/NotI酶切鉴定并再次用同样的方法测序分析。将重组子pJME转化大肠杆菌DH5α,同样的方法小剂量提取质粒,限制性内切酶BamHI/EcoRI进行酶切电泳鉴定,切胶获取JEV prME蛋白编码基因并经测序鉴定。用限制性内切酶BamHI/EcoRI对质粒pcDNA3.1（+）/IgG Fc进行双酶切,将获取的JEV prME蛋白编码基因插于pcDNA3.1（+）/IgG Fc的BamHI/EcoRI酶切位点之间,构建成含有JEV prME蛋白与BALB/c鼠IgG Fc段编码基因的重组子,命名为pJME/IgG Fc。转化pJME/IgG Fc于大肠杆菌DH5α,小剂量提取质粒并分别经BamHI/EcoRI,BamHI/NotI酶切电泳鉴定。2、pJME/IgG Fc稳定转染CHO细胞并获得稳定表达融合蛋白的细胞株确定本实验最佳G418筛选浓度:将常规培养的CHO细胞（1000个/mL）加入24孔板（0.7mL/每孔）孵育,6h后每孔分别加入不同浓度的G418,依次为600mg/L,650mg/L,700mg/L,750mg/L,800mg/L,850mg/L,900mg/L,每种浓度设3个孔,余下3孔为正常细胞对照。培养11d后确定能杀死所有细胞的最低G418浓度作为本实验的最佳筛选浓度,即为800mg/L。采用脂质体转染技术将重组子pJME/IgG Fc转染CHO细胞,同时设空载体pcDNA3.1（+）转染细胞,未转染细胞为阴性对照。具体为:转染实验前天以4×10⁵细胞/mL接种CHO细胞于24孔板中（每孔0.5mL）,37℃,5%CO₂条件下常规培养24h至转染当天细胞达到90%以上汇合。将pJME/IgGFc和pcDNA3.1（+）加入D-MEM培养液中（质粒/培养液:0.8μg/50μl）,脂质体加入D-MEM培养液（脂质体/培养液:2μl/50μl）中室温孵育5min,将稀释的pJME/IgG Fc和pcDNA3.1（+）分别与脂质体稀释液轻轻混匀,室温孵育20min后加入预先经无FCS的D-MEM冲洗的CHO细胞中,常规培养6h后更换为新鲜含10%FCS D-MEM培养液继续培养18h,胰酶消化细胞以1:10的比例接种到新鲜的培养液中,常规培养24h后加入800mg/L G418筛选,根据液体颜色每3d换液1次,加压筛选7d,400mg/L G418浓度继续维持扩大培养阳性克隆。3、免疫荧光检测6孔组织培养板常规培养pJME/IgG Fc转染的CHO细胞,待细胞密度达到60%-70%时,4%多聚甲醛固定细胞1h,0.1%Triton-100打孔10min,10%BSA封闭1h,山羊抗鼠IgG Fc4℃过夜孵育,兔抗山羊CD32 37℃避光孵育1h,50%甘油封片后于荧光显微镜下观察。4、Western-blot分析细胞裂解物经8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,每种样品上样总量30μl,之后转印于PVDF膜过夜,取膜经5%脱脂奶粉室温振荡孵育2h后,将山羊抗鼠IgG Fc抗体与膜4℃过夜孵育,TBST室温洗膜3×10min,将膜与连接辣根过氧化酶兔抗山羊IgG在室温反应1h,再次洗膜3×10min,3’,3’-二氨基联苯胺（DAB）法显色检测pJME/IGFc编码的特异性融合蛋白的表达。实验结果1、pJME/IgG Fc的重组构建巢式-RT-PCR法获得IgG Fc段编码基因经测序分析与发表的IgG Fc CDS区域序列相符合。酶切获取pJME中JEV prME蛋白编码基因,测序分析与发表的基因序列相符合。重组子pJME/IgG Fc经BamHI/EcoRI酶切释出的插入子与pJME经相同酶切释出插入子的分子量大小相一致,又经BamH I/NotI酶切释出的插入子分子量约在2500bps-3000bps之间。DNA测序分析两个目的基因在真核表达载体中正常连接。2、pJME/IgG Fc在CHO细胞中的转染G418最适筛选浓度为800mg/L。将转染pJME/IgG Fc的CHO细胞加压筛选（800mg/L G418）7d,培养板中可见小细胞团簇形成,G418浓度减半（400mg/L）维持培养约30d,普通光镜检查显示小细胞团簇逐步增大,细胞团簇之间逐渐融合。3、pJME/IgG Fc转染的CHO细胞的免疫荧光检测pJME/IgG Fc转染的CHO细胞可见较显著绿色荧光标记,主要分布在胞浆,也可见于胞膜。单纯载体转染或未进行转染的CHO细胞中未见特异性绿色荧光标记,仅见散在的非特异性绿色荧光杂质。4、pJME/IgG Fc转染的CHO细胞的免疫印迹分析将pJME/IgG Fc转染的CHO细胞裂解并提取蛋白进行Western blot分析,在大于Mr约95×10³以上电泳区域内可检测得到一特异性蛋白带,而单纯载体转染或未进行转染的CHO细胞未见相应蛋白带。结论1、构建的重组子pJME/IgG Fc含有prME和IgG Fc基因。2、转染了pJME/IgG Fc的CHO细胞能够稳定表达prME和IgG Fc融合蛋白。3、pJME/IgG Fc表达的融合蛋白相对分子量为101×10³,主要分布在胞浆,少量分布于胞膜。