矽肺病(Silicosis)是在生产过程中长期吸入含有较高浓度游离Si02粉尘所导致的以肺组织不可逆性纤维化为主的疾病,是我国最严重的职业病之一。大量研究表明矽肺纤维化的重要病理特征为肺组织炎性损伤、损伤后错误修复、成纤维细胞过度增殖以及细胞外基质的过多沉积,大量炎性因子、致纤维化因子以及参与相关基因表达的分子(如nicroRNAs、lncRNAs和核因子等)共同形成复杂的相互调控网络,参与矽肺的发生与发展。由于病因复杂,发病机制尚未完全阐明,目前矽肺病无特效治疗方法。近年来,microRNA (miRNA)作为一种非编码小RNA,通过与靶mRNA3’UTR区完全或部分互补结合,导致靶mRNA降解或翻译抑制,参与调控靶基因的表达,在细胞增殖、分化、凋亡、炎症损伤、组织发育及修复过程中发挥着十分重要的作用,这些广泛的生物学作用使其成为疾病治疗的新靶点、诊断及预后判断的生物标志物。NOTCH1蛋白是位于细胞膜上的一个单次跨膜异二聚体受体,是多细胞生物发育过程中高度保守的NOTCH家族的一员,通过与相邻细胞表面配体作用,在细胞的增殖、分化、上皮间质转化以及肿瘤发生发展等过程中起关键作用。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是矽肺发生发展中重要的细胞生物学事件之一。已有研究表明特异性的miRNA通过调控NOTCH信号通路影响肺腺癌、胰腺癌、肾间质纤维化等疾病中的上皮-间质转化,但其对矽尘诱导的肺纤维化的调控作用报道较少。目的：本研究首先通过建立矽尘诱导的小鼠肺纤维化模型,对小鼠肺组织进行miRNA筛检与分析,筛选出矽肺发生发展不同阶段与对照组相比表达有显著差异的miRNAs,进行小鼠肺组织的验证。结合相关文献报道及生物信息学网站分析,从验证结果与芯片结果基本一致的5种miRNAs中选择miR-449a,从组织和细胞两方面探究miR-449a是否通过调控NOTCH1在矽尘诱导的肺纤维化发生发展中发挥作用,为矽肺病发病机制提供新的线索,为寻找新的治疗靶点提供科学依据。方法：(1)矽尘诱导的小鼠肺纤维化模型的建立：经气管一次性直接滴注SiO2粉尘悬液的方式建立小鼠肺纤维化模型,通过病理切片HE染色以及Masson染色观察SiO2粉尘诱导小鼠矽肺发生发展的动态变化过程。(2)肺组织miRNA表达谱检测：依据小鼠肺组织病理切片,选择对照、气管滴注SiO2粉尘7天、14天、28天、56天各1只小鼠肺组织,由博奥公司提取小鼠肺组织RNA,用Affymetrix miRNA 30芯片进行miRNA表达谱的检测。(3)1niRNA表达谱检测结果分析：筛选出与对照组比较,至少在二个矽尘处理组中差异表达两倍及以上的miRNAs,在此基础上选择表达原始值大于100的niRNAs。(4)小鼠肺组织差异表达miRNAs验证及其靶基因预测分析：提取矽尘处理不同时间段及对照组各5只小鼠的肺组织RNA,用qRT-PCR验证筛选出的miRNAs,对小鼠肺组织验证与芯片结果一致的miRNAs,进一步通过查阅文献并结合miRDB、TargetScan、 miRNA.org、miRWalk、DIANAmT生物信息学软件找出已经确认的靶基因和部分预测的靶基因,并利用MAS3.0网站对其调控的信号通路进行分析。(5)肺组织中NOTCH1、E-Cadherin及α-SMA检测：用qRT-PCR, Western blot等实验技术检测小鼠肺组织内NOTCH1以及上皮细胞标志物E-Cadherin、间质细胞标志物α-SMA的动态表达情况。(6)细胞模型中观察miR-449a调控NOTCH1的表达：应用HBE细胞构建SiO2粉尘刺激的细胞模型,通过体外转染miR-449a相似剂使其高表达,应用qRT-PCR、Western blot等实验技术观察细胞中miR-449a、NOTCH1以及下游分子Snail、E-Cadherin、α-SMA的表达情况。结果：1.小鼠矽肺组织病理变化：病理切片HE染色显示,在SiO2粉尘处理的第7天,即可见肺泡内有明显的炎性细胞聚集,随着处理时间的延长,肺泡结构破坏加重,粉尘处理第56天时可见大量的矽肺结节存在,肺组织广泛纤维化；Masson染色结果显示,粉尘处理第28天开始,可见大量胶原纤维产生,肺纤维化程度明显加重。2. miRNA表达谱筛检(1)在染尘后7天、14天、28天、56天各时间段至少一组较对照组上调或者下调两倍及以上的miRNAs共232种,至少两组较对照组差异表达两倍及以上的miRNAs共有97种,其中表达原始值大于100的有16种,包括上调的9种niRNAs和下调的7种miRNAs。(2)用qRT-PCR验证发现5种niRNAs (miR-21、miR-486、miR-449a、miR-3107、miR-455)的表达与芯片结果基本一致,其中,miR-21在矽尘处理各期呈现高表达,miR-3107、miR-486和miR-455在矽尘处理组呈现低表达,而miR-449a呈现早期高表达、中晚期低表达。(3)通过查阅文献并结合生物信息学网站miRTarBase、TarBase、miRecords联合查看差异表达的5种miRNAs(miR-21、miR-486、miR-449a、miR-3107、miR-455)已经证实的靶基因,并且应用多个生物信息软件联合预测5种miRNAs尚未被证实的可能调控的靶基因,其中miR-449a参与调节NOTCH、PDGF、MAPK、Wnt、P53等多种信号通路。(4) NOTCH1是miR-449a的靶基因：通过查阅文献并结合生物信息学网站TargetScan等预测显示miR-449a与NOTCH1的3’-UTR在第167-190个碱基处有结合。3.miR-449a通过靶向调节NOTCH1影响矽尘诱导的EMT(1)小鼠肺组织中NOTCH1与EMT标志物表达情况Western blot和qRT-PCR实验分别在蛋白和mRNA表达水平上证实矽尘组小鼠肺组织NOTCH1在28、56天表达增高,上皮细胞标志物E-Cadherin表达降低,间质细胞标志物α-SMA表达增高。(2)细胞模型显示不同浓度SiO2粉尘处理HBE细胞12h、24h、48h后,随着粉尘浓度的增大,NOTCH1、α-SMA表达增高,E-Cadherin表达降低,尤其在粉尘浓度为150μg/ml处理HBE细胞24h后,NOTCH1、E-Cadherin、α-SMA蛋白表达改变最为显著。用150μg/ml SiO2粉尘处理HBE细胞12h、24h、48h后,miR-449a在不同时间表达均降低,以24h表达下调最为明显。(3)转染miR-449a的相似剂之后,HBE细胞中miR-449a的表达量较对照组以及阴性对照转染组增加了约5000倍,而阴性对照转染组与对照组相比miR-449a的表达量基本一致。Western blot证实转染miR-449a相似剂后给予Si02粉尘处理与Si02粉尘处理组比较,NOTCH1、α-SMA表达降低,E-Cadherin表达增高,提示高表达miR-449a能够抑制EMT。(4)Western blot检测小鼠肺组织中Snail的表达,发现在矽尘处理28、56天表达增高,与NOTCH1变化一致。50μg/ml SiO2粉尘处理HBE细胞24h后,Snail表达也增高。HBE细胞转染miR-449a相似剂后Si02处理组与对照比较,Snail表达降低,与NOTCH1的表达一致。结论：在矽尘诱导的小鼠肺纤维化发生发展中,miR-449a在矽尘处理后炎症早期高表达,纤维化形成期低表达,NOTCH1表达与之相反,同时在纤维化中后期发生了EMT。在SiO2刺激HBE细胞模型中,miR-449a表达降低,NOTCH1表达增高,在这个过程中也发生了EMT,而miR-449a相似剂能够抑制HBE细胞的EMT。这些结果均提示miR-449a负调控NOTCH1的表达,进一步影响下游分子Snail引起EMT标志物E-Cadhrin、α-SMA的表达改变,促进上皮细胞间质转化,影响肺纤维化进程。