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近年来,随着人们对自然界半纤维素资源的开发利用,木聚糖酶作为一种绿色高效环保的生物催化剂,已被广泛应用于饲料、食品、造纸、医药、纺织及能源等诸多工业领域。它主要作用于木聚糖主链,随机切割木聚糖内部的β-1,4糖苷键,水解产生不同聚合度的木寡糖和少量木糖。虽然国内外已有大量木聚糖酶被克隆表达,但多数为中温木聚糖酶,对于工业化应用的高温环境来说,木聚糖酶的使用受到了很大的限制。因此中温木聚糖酶的耐热性改造具有重要意义。本实验室前期已克隆并表达了一种源于米曲霉(Aspergillus oryzae)糖苷水解酶(GH)11家族中温木聚糖酶AoXyn11A,此酶活性高、pH范围广且金属离子耐受性好,但耐热性差。本课题以AoXyn11A为研究对象,通过N-端置换和定点突变方法,以改善其耐热性并探讨木聚糖酶耐热机理。根据AoXyn11A和一个源于嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的同家族耐热木聚糖酶pXYL11的序列比对及分子动力学模拟B-factor值的计算结果,确定用pXYL11 N-端区域的氨基酸片段(A1~T42)置换AoXyn11A相对应的片段(S1~V41),采用大引物PCR技术扩增杂合酶ATX11A基因(ATx11A),并在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中表达,结果表明,杂合木聚糖酶ATX11A的最适反应温度(Topt)为65℃,较原酶(AoXyn11A)提高15℃,在60℃下,ATX11A的半衰期t1/260为55 min,较AoXyn11A(t1/260=1.3 min)延长了41.3倍。根据AoXyn11A与其他5种11家族耐热木聚糖酶(包括pXYL11)的多序列比对结果,进一步将ATX11A“cord”结构区域内的氨基酸96NPGSG100突变为RPT,构建突变酶ATX11AM基因(ATx11AM),并在P.pastoris GS115中表达。结果表明,ATX11AM的Topt与ATX11A的相同,但ATX11AM的t1/260由ATX11A的55 min提高到了83 min。ATX11AM的t1/265为31 min,是ATX11A(t1/265=17 min)的1.8倍。另外,测得ATX11A和ATX11AM的熔解温度(Tm)分别为72.7和77.9℃,分别较AoXyn11A(Tm=60.2℃)提高了12.5和17.7℃。根据对一级和三维结构的分析,发现在ATX11A的N-端引入了两个盐桥(H10-D11和D11-K49)和两个N-糖基化位点(N5-E-T7和N34-Y-S36)。为了探讨木聚糖酶ATX11A的耐热机理,首先,利用定点突变法,将D11突变成原酶AoXyn11A中的N,以同时去除两个盐桥,构建突变酶基因ATx11AD11N,并在P.pastoris GS115中表达,结果显示,ATX11AD11N的Topt由突变前的65℃降为60℃,在55和60℃下分别保温60 min后,ATX11A残余酶活性分别为初始酶活性的79.4%和49.9%,而ATX11AD11N的仅为42.3%和17.8%。说明引入的N-端盐桥是影响ATX11A耐热性的原因之一。然后,利用定点突变法,将N5和N34均突变成原酶AoXyn11A中的S,以去除两个N-糖基化位点,构建突变酶基因ATx11AS,并在P.pastoris GS115中表达,结果显示,ATX11AS的Topt并没有下降,仍为65℃;与突变前相比,在55和60℃下分别保温60 min后,ATX11AS的残留酶活性变化均不明显,说明N-糖基化对ATX11A耐热性影响不大。