目的：建立第8胸椎(T8)半切型脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)大鼠模型,并采用过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)诱导氧化应激损伤的PC12细胞作为神经损伤的细胞模型,从抗氧化、抗炎、抗凋亡等方面探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate, EGCG)对脊髓损伤急性期的保护作用及其可能机制。方法：从在体和离体两方面来研究EGCG对脊髓损伤的影响。1在体实验：(1)半切型脊髓损伤模型的建立及分组与给药成年雌性SD大鼠T8处半切脊髓,造成SCI模型后随机分为6组：假手术组(暴露脊髓,但不进行半切)、模型组(SCI组)、阳性药组(甲基强的松龙,methyllpredriisolone sodiu succinate, MPSS,100mg/kg)、EGCG低剂量组(25mg／kg)、EGCG中剂量组(50 mg／kg)、EGCG高剂量组(100 mg／kg)。动物SCI术后5 min,假手术组和模型组给予生理盐水(10 ml／kg,ip),其余各组ip给予生理盐水配制的药物。(2)SCI急性期脊髓组织病理组织学及超微结构的观察SCI大鼠给药24 h后以损伤处为中心取下2 cm脊髓,放入含1 ml多聚甲醛溶液的EP管中避光保存做HE染色的病理切片；以损伤处为中心取下1 cm脊髓,用面刀切成1 mm3的小块置于2.5% 0.5 ml的戊二醛溶液中做透射电镜。(3)SCI急性期血清炎症因子的检测SCI大鼠给药24 h后摘右眼球取血5 ml,取血清,采用ELISA法测定血清白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)含量。(4)SCI急性期抗氧化酶系统与活性氧簇的测定SCI大鼠给药24 h后取脊髓制备成1%的组织匀浆,根据试剂盒说明书检测脊髓中SOD、MDA、O.2-、NO水平。取脊髓组织制备成凝胶电泳样本,采用Western blot法测定脊髓中iNOS蛋白表达水平。(5)SCI急性期凋亡有关因子B-细胞淋巴瘤／白血病-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的检测SCI大鼠给药24 h后,取脊髓组织制备成凝胶电泳样本,采用Western blot法测定脊髓中Bcl-2和Bax蛋白表达。(6)SCI急性期内源性神经营养因子营养因子-3(NT-3)和脑源性神经营养因子(BDNF)的测定SCI大鼠给药24 h后,取脊髓组织制备成凝胶电泳样本,采用Western blot法测定脊髓中内源性神经营养因子NT-3和BDNF蛋白表达。2离体实验：(1)H2O2诱导的细胞损伤模型的建立PC12细胞以2×105／cm2接种在50 ml细胞培养瓶,常规培养,培养液每天更换一次,48h内当细胞汇集至80%时进行传代接种。细胞加药处理前采用清饥饿法使之同步化。加入H2O2(终浓度100～600μmol／L)孵育2 h,用噻唑蓝(MTT)法确立PC 12细胞损伤模型。(2)EGCG对H2O2诱导氧化应激损伤的PC12细胞的保护作用细胞用EGCG和H2O2处理后,收集细胞培养液,根据乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒说明检测细胞外LDH水平,用以检测细胞膜通透性及完整性；采用MTT法观察细胞线粒体完整性与细胞活力；收集EGCG和H2O2处理后的细胞,用流式细胞术测定细胞周期分布以及细胞增殖率；将细胞接种至内有爬片的6孔培养板,孵育、同步化,用EGCG和H2O2处理后,吸弃上清液,每孔加入10μmol／L BrdU液1 ml,孵育24 h,BrdU免疫荧光法检测细胞周期相S期DNA增生。(3)EGCG对H2O2诱导氧化应激损伤的PC12细胞保护作用的机制收集EGCG和H2O2处理后细胞,试剂盒测定细胞内抗氧化酶系统超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的水平。同时根据试剂盒说明书依次测定活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)中超氧自由基(O.2-)、羟自由基(·OH)、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)的活性与一氧化氮(NO)含量。采用Western blot检测iNOS蛋白水平,采用real timeRT-PCR测定iNOS-mRNA水平。结果：从离体和在体两方面结果来研究EGCG对脊髓损伤的影响。1在体实验：(1)EGCG对脊髓损伤急性期脊髓组织病理组织学及超微结构的影响HE染色后光学显微镜下观察发现,假手术组大鼠脊髓灰、白质组织结构完整,SCI组脊髓组织切片在损伤区中央灰质可见大片血细胞,并有大量单核或多核的炎性细胞浸润,并可出现囊腔样变化。EGCG低、中剂量组脊髓组织空泡变性减轻,可见血细胞与炎症细胞,以单核或多核炎性细胞为主,但明显低于SCI组。EGCG高剂量组与阳性对照药MPSS组,损伤部位脊髓组织结构排列较完整,偶见炎性水肿,损伤脊髓组织未见明显细胞凋亡,白质内神经纤维排列整齐。透射电子显微镜观察了脊髓组织神经元和轴突。假手术组脊髓灰质内神经元与白质各索髓鞘规则。SCI组脊髓灰质内神经元胞体固缩,白质髓鞘排列松散。EGCG 25～50 mg／kg组脊髓灰质内能频繁见到胞体肿胀的神经元,髓鞘变薄排列松散。EGCG 100 mg／kg组脊髓灰质内神经元与白质髓鞘结构基本正常。(2)EGCG对脊髓损伤急性期血清炎症因子的影响大鼠脊髓半切24 h后,SCI组血清炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、ICAM-1、TNF-α含量增加,与假手术组比较有显著统计学差异(P<0.01)。EGCG 25、50、100 mg／kg三个浓度分别作用于SCI大鼠24 h,血清IL-1β、IL-6、ICAM-1、TNF-α含量均减少,与SCI组比较有统计学差异(P<0.05),血清IL-8含量亦减少,与SCI组比较,EGCG 25 mg／kg无统计学差异(P>0.05),50、100 mg／kg有显著统计学差异(P<0.01)。(3)EGCG抗氧化作用大鼠脊髓半切24 h后,SCI组脊髓组织SOD水平下降,MDA水平增加,与假手术组比较有显著统计学差异(P<0.01)。EGCG 25、50、100 mg／kg三个浓度分别作用于SCI大鼠24 h,脊髓组织SOD水平增加,MDA水平减少,与SCI组比较有统计学差异(P<0.05)。大鼠脊髓半切24 h后,SCI组脊髓组织抑制O.2-活性能力下降,NO水平显著增加,与假手术组比较有显著统计学差异(P<0.01)。EGCG 25、50、100 mg／kg三个浓度分别作用于SCI大鼠24 h,脊髓组织抑制O.2-活性能力增加,与SCI组比较有统计学差异(P<0.05);EGCG三个浓度亦减少脊髓组织NO水平,与SCI组比较,EGCG 25 mg／kg剂量组无统计学差异(P>0.05),EGCG 50、100 mg／kg剂量组有显著统计学差异(P<0.01)。Western blot实验结果显示,大鼠脊髓半切24 h后,SCI组脊髓组织iNOS蛋白表达水平增加,与假手术组比较有显著统计学差异(P<0.01),EGCG 25、50、100 mg／kg三个浓度分别作用于SCI大鼠24 h,脊髓组织iNOS蛋白表达水平减少,与SCI组比较有显著统计学差异(P<0.01)。(4)EGCG抗凋亡作用Western blot实验结果显示,大鼠脊髓半切24 h后,SCI组脊髓组织Bcl-2蛋白表达水平下降,Bax蛋白表达水平与Bax/Bcl-2蛋白表达比率增加,与假手术组比较有显著统计学差异(P<0.01)。EGCG 25、50、100 mg／kg三个浓度分别作用于SCI大鼠24 h,脊髓组织Bcl-2蛋白表达水平增加,Bax蛋白表达水平与Bax/Bcl-2蛋白表达比率减少,其中,与模型组比较,25 mg／kg组没有统计学差异(P>0.05),EGCG 50、100 mg／kg剂量组有统计学差异(P<0.05)。(5)EGCG对脊髓损伤后急性期神经营养因子NT-3和BDNF的影响Western blot实验结果显示,大鼠脊髓半切24 h后,脊髓组织NT-3、BDNF蛋白表达水平下降,与假手术组比较有显著统计学差异(P<0.01)。EGCG 25、50、100 mg／kg三个浓度分别作用于SCI大鼠24 h,脊髓组织NT-3、BDNF蛋白表达水平增加,其中,与模型组比较,25 mg／kg组没有统计学差异(P>0.05),EGCG 50、100 mg／kg剂量组有统计学差异(P<0.05)。2离体实验：(1)H2O2诱导的PC12细胞损伤模型倒置显微镜下观,空白对照组细胞贴壁生长牢固,体积饱满,充分伸展,细胞明亮清晰,折光性好,而损伤组PC12细胞体积明显缩小,突起消失,胞体变小,细胞间隙增大,细胞分布变稀疏的,折光性下降,细胞皱缩,出现不同程度的脱壁,出现明显损伤形态。损伤程度以600μmol／L H2O2最严重的。MTT实验结果显示,与空白对照组相比,100～300μmol／L H2O2剂量能降低细胞活力,但是没有统计学意义,400～600μmol／L剂量能降低细胞活力,且具有显著统计学意义(P<0.01)。(2)EGCG对H2O2诱导氧化应激损伤的PC12细胞的保护作用LDH水平反映了细胞膜完整性的程度,膜外LDH水平高,则细胞膜受损程度高。500μmol／L H2O2孵育PC12细胞2 h,膜外LDH水平升高,与空白对照组比较有显著统计学差异(P<0.01)。EGCG预孵1 h,5、10、20μmol／L剂量组能降低膜外LDH水平,与H2O2组比较有统计学差异(P<0.05)。MTT法测定受损PC12细胞活力与线粒体的完整性,结果显示,EGCG 5-30μmol／L浓度组能显著改善500μmol／L H2O2所致的PC12细胞线粒体的损伤,能显著增加受损细胞的活力,与H2O2组比较有统计学差异(P<0.05)。流式细胞术结果显示,500μmol／L H2O2孵育PC12细胞2 h,G0／G1期细胞分布百分率增加,细胞周期S期细胞分布百分率与细胞增殖率减少,与空白对照组比较有显著统计学差异(P<0.01)。EGCG预孵1 h,5、10、20μmol／L三个剂量能降低G0／G1期细胞分布百分率,升高细胞增殖率,与H2O2组比较有统计学差异(P<0.05)。EGCG三个剂量组能升高S期细胞分布百分率,与H2O2组比较,5μmol／L组无统计学差异(P>0.05),10μmol／L与20μmol／L组有显著统计学差异(P<0.01)。S期DNA合成通过BrdU免疫荧光染色实验来检测。500μmol／L H2O2孵育PC12细胞2 h,BrdU阳性细胞数减少,与空白对照组比较有显著统计学差异(P<0.01)。EGCG预处理1 h,5、10、20μmol／L三个剂量组能升高BrdU阳性细胞数,与H2O2组比较有显著统计学差异(P<0.01)。(3)EGCG对H2O2诱导损伤PC12细胞保护作用的机制细胞经H2O2诱导损伤后,SOD、GSH-Px水平下降,MDA水平上升,与空白对照组比较有统计学差异(P<0.05)。EGCG预孵1h,5、10、20μmol／L三个剂量组细胞内SOD、GSH-Px水平上升,MDA水平下降,与H2O2组比较有显著统计学差异(P<0.01)。细胞经H2O2诱导损伤后,细胞内抑制O.2-活性能力下降,产生·OH能力增加,与空白对照组比较有显著统计学差异(P<0.01),EGCG预孵1 h,5、10、20μmol／L三个剂量组细胞内抑制O.2-活性能力增加,产生OH能力减少,与H2O2组比较有显著统计学差异(P<0.01)；细胞经H2O2诱导损伤后,细胞外NO水平与细胞内iNOS活性上升,与空白对照组比较有显著统计学差异(P<0.01),EGCG预孵1 h,三个剂量组细胞内iNOS活性与细胞外NO水平下降,与H2O2组比较有显著统计学差异(P<0.01)；Western blot与real time RT-PCR实验结果显示,细胞经H2O2诱导损伤后,细胞细胞内iNOS蛋白与mRNA表达上升,与空白对照组比较有显著统计学差异(P<0.01),EGCG三个剂量组细胞内iNOS蛋白与mRNA表达水平下降,与H2O2组比较,5μmol／L无统计学差异(P>0.05),10μmol／L与20μmol／L两剂量组有统计学差异(P<0.05)。说明EGCG能有效拮抗H2O2导致的iNOS蛋白与mRNA表达的增加,能抑制iNOS-NO通路的激活。结论：我们采用T8处半切大鼠脊髓造成SCI体内损伤模型,以及采用H2O2诱导PC12细胞损伤造成神经损伤体外模型,在体与离体给予EGCG干预,通过生化指标及病理的指标观察EGCG对脊髓损伤的作用,主要结论如下：(1)EGCG能保护SCI大鼠受损脊髓,这种保护作用源于：减少SCI大鼠血清炎症因子含量,有显著抗炎作用；提高SCI大鼠脊髓中抗氧化酶系统活性,抑制氧自由基及iNOS-NO通路的激活而发挥抗氧化作用；下调凋亡基因Bax的表达,上调抗凋亡基因Bcl-2的表达而产生抗凋亡作用；同时促进内源性神经营养因子NT-3、BDNF的表达。(2)EGCG能够维持受损PC12细胞膜完整性,保护细胞的线粒体,延长细胞周期的S期及促进该期DNA合成,增加受损细胞的增殖率。这种神经保护作用源于EGCG提高SOD、GSH-Px等抗氧化酶活性,降低ROS活性,抑制iNOS-NO通路的激活。