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尼罗罗非鱼是我国南方地区淡水养殖业的重要养殖品种之一,但我国罗非鱼养殖缺乏耐寒品种,在寒灾和早春期间罗非鱼因低温出现大量死亡。热休克蛋白是一类生物体在高温、低温、化学毒性等应激条件下诱导表达的蛋白,可以辅助其他蛋白维持正确构象。
为了研究尼罗罗非鱼耐寒性状的分子基础并为耐寒品种选育提供参考,本研究从尼罗罗非鱼中克隆了HSP60家族TCP-1-beta和TCP-1-eta以及Hop的完整编码序列,并对其分子特征和低温诱导下的表达情况进行了分析,同时采用SNP的方法寻找TCP-1-eta与罗非鱼耐寒性状的相关性。
本研究获得TCP-1-beta cDNA序列1755bp,包括1605bp的完整开放阅读框,编码534个氨基酸,TCP-1-eta cDNA序列1651bp,包括1638bp的完整开放阅读框,编码545个氨基酸,Hop cDNA序列1634bp,包含1623bp完整开放阅读框,编码541个氨基酸。多序列比对发现,TCP-1-beta、TCP-1-eta以及Hop蛋白在物种间同源性很高,TCP-1-beta、TCP-1-eta都具有CCT蛋白保守的ATP结合位点等,Hop具有9个特征性的TPR基序。遗传进化分析发现三者都和硬骨鱼类聚为一支。实时荧光定量PCR检测到TCP-1-beta、TCP-1-eta、Hop以及hsp70在尼罗罗非鱼各组织普遍表达,在肌肉组织中优势表达;从22℃至12℃的范围内,不同低温诱导48小时后均上调表达,而且随着诱导温度的降低,表达上调幅度增大,至12℃时表达量达到最高。这些结果预示TCP-1-beta、TCP-1-eta、Hop以及hsp7D可能在尼罗罗非鱼低温耐受中起作用,是潜在的耐寒相关基因。
TCP-1-eta cDNA序列的1441位点存在C→T变异(C1441T),该SNP位点不改变TCP-1-eta编码的氨基酸序列,但该位点导致所在位点附近酶切位点的变化。通过PCR-RFLP和SPSS13.0软件对群体进行基因型分型和关联分析,TT基因型的耐寒能力强于TC基因型。