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粘细菌是一类具有复杂多细胞行为的原核生物,在细胞生长、捕食、运动及发育等方面表现出显著的社会性特征,是目前原核生物中已知的唯一具有多细胞行为特征的类群。目前粘细菌的研究主要集中在两个方面,一方面粘细菌被认为是最高等的原核生物,其独特的多细胞行为以及复杂的发育调控机制已经被越来越多的研究者所关注,尤其是粘细菌的子实体发育过程中所涉及的细胞间信号传导过程的研究;另一方面粘细菌在生长的过程能够合成多种具有生物活性的次级代谢产物和分泌一些具有特殊活性的糖苷水解酶类,其中一些有着巨大的药物开发价值以及市场应用潜力。本研究将以实验室保存的一株粘细菌EGB为材料,对生长过程中分泌的具有特殊生物学功能以及实际应用价值的糖苷水解酶进行详细的研究。本研究发现粘细菌株EGB具有良好的抗真菌能力,经过生理生化和16S rDNA系统发育分析,将其初步鉴定为珊瑚球菌属(Corallococcus sp.)。菌株EGB具有广谱抗真菌活性,对稻曲病菌、稻瘟病菌、黄瓜枯萎病菌、棉花枯萎病菌、棉花黄萎病菌等真菌以及辣椒疫霉、大豆疫霉等卵菌均具有很好的抑制效果,对峙生长过程中真菌菌丝坍塌,真菌生长明显受到抑制。盆栽实验结果发现,菌株Corallococcussp.EGB可以有效的降低黄瓜枯萎病的发病率,菌株EGB的胞外上清酶液能够有效的降低稻瘟病菌的感染能力。进一步研究发现菌株EGB抗真菌作用与已报道抗真菌次级代谢产物的作用机制不同,推测Corallococcus sp.EGB的胞外上清液中可能含有某种抗真菌蛋白。通过对Corallococcus sp.EGB胞外上清酶液底物谱分析和水解酵母细胞壁糖组分分析,发现菌株EGB胞外上清中可能存在一种β-1,6-葡聚糖酶,参与菌株对真菌的抑制作用。通过底物吸附解吸等多种蛋白纯化手段从Corallococcussp.EGB胞外上清粗酶液中纯化得到一个具有β-1,6-葡聚糖水解酶活性的蛋白GluM,比酶活力约为24 000 U·mg-1。底物谱分析发现GluM专一性的水解β-1,6-糖苷键连接的葡聚糖,尤其对短链β-1,6-葡聚糖活性最高。GluM具有较好的温度适应性,最适反应温度为50℃,最适pH值为7.0。纯化β-1,6-葡聚糖酶pGluM对稻瘟病菌菌丝和孢子均具有很好的水解作用,酶处理后菌丝和孢子变形,结构不完整。综合肽指纹图谱分析结果并参考Corallococcus corallococcus DSM 2259的全基因组序列设计相关引物,克隆了菌株Corallococcus sp.EGB P-1,6-葡聚糖酶GluM的完整ORF基因序列。gluM全长3222 bp,编码1073个氨基酸。GluM等电点为5.37,分子量大小为116.13 kDa,前26个氨基酸为一个典型的信号肽序列。对GluM进行区域表达发现其活性中心主要集中在N端500个氨基酸。NCBI上以Protein Blast进行比对发现GluM与来源于Ccoralloides DSM 2259的TonB通道蛋白(TonB-dependent receptor)一致性达到93%,与来源于Myxococcus xanthus DK 1622的Oar蛋白(OmpA-related protein)序列一致性达到80%,与具有β折叠桶状结构的膜蛋白以及铁离子运输蛋白具有一定的同源性,而与报道的糖苷水解酶没有任何的同源性。基于该蛋白功能以及序列分析结果,初步将该蛋白定义为一个新的糖苷水解酶家族GH136。对蛋白GluM在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行异源表达,通过底物吸附解吸的方式实现对重组蛋白rGluM的纯化。rGluM能够有效的抑制稻瘟菌孢子萌发,与直接从野生菌上清中纯化到的pGluM具有相同的抑制作用。综合上清酶液、截留分子量10 kDa超滤下液以及热失活上清液处理结果,表明菌株EGB的抗真菌能力主要是通过分泌一种可溶性β-1,6-葡聚糖GluM裂解真菌细胞壁来实现的。GluM序列分析结果表明,GluM与来源于Myxococcus xanthus DK1622的Oar蛋白(OmpA-related protein)的氨基酸序列一致性达到80%,据文献报道Oar蛋白参与粘细菌子实体的形成。本论文对Oar蛋白参与粘细菌发育过程的具体机制研究发现,Oar蛋白参于粘细菌子实体的形成和粘细菌捕食行为等过程。进一步研究发现Oar为一种外膜型通道蛋白,具有糖运输能力。对菌株DK1622上清组分分析发现,Oar蛋白参与形成一种活性组分,能够恢复oar缺陷菌株子实体的形成。通过初步的实验判断,该活性组分是一种分子量小于10 kDa的低聚糖。推测该低聚糖是作为一种信号分子参与到粘细菌细胞间细胞传导过程,进而影响粘细菌的发育过程。通过底物吸附解吸等多种纯化手段从Corallococcus sp.EGB胞外上清粗酶液中纯化得到一个高活性α-1,4-淀粉酶AmyM,产物分析发现该淀粉酶对淀粉的水解产物主要为麦芽六糖。根据肽指纹图谱肤段序列并参考Corallococcus coralloides DSM 2259基因组序列,成功获得该淀粉酶的完整序列。序列分析发现AmyM包含N端前23个氨基酸的典型信号肽,等电点为6.45,分子量大小为55.46kDa。BlastP序列比对结果显示淀粉酶AmyM属于淀粉酶GH13水解酶家族,为一个新的产麦芽六糖淀粉酶。AmyM的比酶活性高达14 000 U·mg-1,与文献报到的淀粉酶相比较AmyM的活性是最高的。酶学性质研究表明AmyM最适温度为50℃,最适pH为7.0,且活性不依赖于Ca2+。该酶在一些常见化合物存在和高盐浓度情况下有很好的稳定性,酶活性几乎不受影响。在应用于生淀粉的处理实验中,以诺维信商业化淀粉酶BAN800作为对照,发现与商业淀粉酶BAN800的复杂的寡糖产物相比较,淀粉酶AmyM水解产物单一,主要为麦芽六糖,其中麦芽六糖占总低聚糖含量的54%,显示出了较BAN800更好的优越性。