FYF基因的克隆及转化桂花和大岩桐

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花的衰老是由外界环境因素和内部衰老因子共同作用的结果,而乙烯是目前研究得最深入的内部衰老因子之一,也是对花衰老作用最大的一种内源激素。花瓣的衰老是由乙烯的生物合成和信号转导复杂调控的结果,在花发育和衰老过程中可以通过阻断乙烯生物合成或信号转导某一环节来推迟花瓣衰老。目前有研究表明MADS-box基因AGL42也叫FOREVER YOUNG FLOWER(FYF)基因能够有效抑制乙烯反应下游基因的表达,使转基因植株对乙烯不敏感,从而达到延迟花衰老的目的。为了进一步探讨FYF基因在花衰老过程中的功能,本研究从拟南芥中克隆到FYF基因,构建了其植物表达载体,并转化几个桂花品种和大岩桐。  本研究主要内容包括:⑴优化了桂花的再生体系。不同浓度玉米素诱导大花金桂子叶切块愈伤组织分化芽的影响结果表明:玉米素浓度为2.0mg·L-1培养基上分化出芽,0.5 mg·L-1的玉米素培养基上分化出根,随着培养时间的加长发现玉米素浓度越高的培养基上愈伤组织褐化率越大,最适诱芽培养基为1/2MS+2.0mg·L-1ZT+0.25 mg·L-1 TDZ;同时还研究了不同激素条件对几个品种离体培养的桂花幼胚存活率、出芽率、幼苗平均株高以及平均丛生芽数等的影响。实验结果表明:籽银桂幼胚在1/2 MS+0.5mg·L-1TDZ+0.1 mg·L-1NAA培养基上培养,幼胚存活率为100%、萌芽率为50%、幼苗平均株高为3.9cm,丛生芽数达3个。莲子丹桂幼胚存活率高达100%,其幼苗平均高度为2.2cm。“庐州黄”籽银桂平均丛生芽数多达3个。⑵克隆了拟南芥FYF基因并构建植物超表达载体。以拟南芥花芽cDNA为模板,扩增得到FYF基因,利用BamH I和Pst I酶切位点,将FYF目的片段与质粒 pCAMBIA13011连接,构建植物超表达载体pCAMBIA13011-FYF,将构建好的表达载体转化根癌农杆菌GV3101。⑶用含有FYF基因的农杆菌GV3101侵染几个桂花品种的愈伤组织,经过半个月的延迟筛选培养和半年的筛选培养最终得到Kan抗性愈伤组织,经分子检测获得一批转基因桂花愈伤组织。目前抗性愈伤组织正在诱导形成芽过程中。⑷用含有FYF基因的农杆菌GV3101侵染大岩桐幼叶,先诱导出抗性愈伤,再形成抗性芽,用试剂盒提取候选转基因植株的DNA,经PCR鉴定,已获得FYF基因转化的大岩桐植株,目前,FYF基因转化植株正在诱导生根过程中。
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