红细胞是血液中数量最多的一种细胞,在人体新陈代谢和气体运输方面起着非常重要的作用,其机能主要由胞内的血红蛋白完成。而外部环境的变化,如渗透压、药物处理、氧气分压等可能引起红细胞内血红蛋白分子构象发生变化。研究红细胞及其血红蛋白的结构和功能有助于深入了解红细胞的携氧功能甚至血液疾病的病理,为诊断和治疗提供理论依据。地中海贫血(简称地贫)是一种由于珠蛋白基因缺失或缺陷使珠蛋白链的合成受到部分或完全抑制而引起的遗传性溶血性贫血。该疾病在我国南方地区发病率较高,主要分为α-地贫和β-地贫两种类型。目前尚无有效的根治方法,只能筛查地贫患者,避免重型地贫患儿的出生以控制该病的蔓延。但常规的基于细胞群体或血红蛋白的检测方法,操作繁琐,工作量大,费用相对昂贵,不适合大面积人群的筛查。此外,研究指出地贫红细胞结构的变化在携氧能力上也表现出差异。因此,发展一种快速简便、低成本的地贫检测方法,及监测红细胞的氧合和去氧的动力学行为,评价其携氧功能具有重要的临床应用意义。作为一种无损、快速而灵敏的光谱学检测方法,拉曼光谱技术在生物医学领域的应用日渐广泛。由于水的拉曼散射非常微弱,因此该技术适合于水溶液环境中的生物大分子、细胞等的研究。激光镊子和显微拉曼光谱相结合的光镊拉曼光谱(Laser tweezers Raman spectroscopy,LTRS)技术,利用光镊俘获和囚禁细胞,可消除普通显微拉曼光谱技术将细胞固定在玻片上所引起的不良影响,并获得信噪比更高的光谱。LTRS技术在单个功能红细胞的研究中已表现其独特的优势。有望实现地贫的诊断和携氧功能的研究。但系统噪声和荧光效应等引起的高强度的光谱背景,将降低谱线强度与背景的比值,以至于严重影响了基于光谱强度的分析结果。因此进行光谱数据有效处理是必要的。本文应用LTRS系统收集正常对照、中间型α-地贫(HbH、HbH-CS)和重型β-地贫的红细胞的拉曼光谱,采用最小二乘多项式曲线拟合进行光谱背景(也称基线)校正,聚类分析、主成分分析、神经网络等用于光谱数据压缩或模式识别,实现不同地贫类型的判别。此外,分析单细胞的氧合及去氧动力学过程及细胞差异性。主要开展了以下四个研究工作:(1)针对系统噪声和荧光效应等引起高强度光谱背景影响基于光谱强度的统计分析结果的问题,利用最小二乘多项式进行光谱背景的拟合并去除背景。通过对比不同的数据处理方法聚类分析结果,表明最小二乘多项式曲线拟合进行光谱基线校正可显著提高地贫红细胞与正常人红细胞的识别度。其中,α-地贫HbH组与正常对照组间的平均区分度为90.32%,α-地贫HbH-CS组与正常对照组间的区分度97.6%,远高于其他处理方法的结果。而且,该方法对实验系统稳定性要求不高。(2)将主成分分析(PCA)算法和BP网络预测模型相结合,进行地贫红细胞类型的判别。PCA结果显示,正常对照与α-地贫HbH-CS基本可区分,但正常对照与重型β-地贫、α-地贫HbH-CS与重型β-地贫间差异不明显。将归一化处理的前五个主成分进行BP网络训练及预测,结果发现,正常对照与α-地贫HbH-CS间预测正确率高达97.90%,正常对照与重型β-地贫、α-地贫HbH-CS与重型β-地贫间预测正确率分别为90.72%和86.28%。该结果与平均拉曼光谱及主成分分析结果基本吻合。取不同的实验条件下收集的光谱进行同样的分析,三种组合的预测正确率略有不同,分别为95.28%,92.08%,91.85%,但呈现基本相同的规律。(3)激光镊子共焦显微拉曼光谱与气体控制装置相结合,窥视红细胞的携氧能力。分析激光功率对氧合状态分析的影响,氧合态和去氧态的对比及区分指标的选择,并运用该指标分析了不同保存时间、不同健康状态红细胞的携氧能力。结果发现,较强功率的激光照射细胞会导致其亚铁血红素聚合特征峰1248 cm-1、1371 cm-1升高;I1638/I1547是区分氧合态与去氧态的良好标志;经较长时间保存的红细胞氧合能力增强,但去氧能力没有发生显著性变化;α-地贫HbH-CS红细胞氧合能力比正常对照的强,但其去氧能力较差。(4)应用光镊拉曼光谱系统监测地贫和正常对照单个红细胞氧循环过程光谱的变化。在单细胞的水平上研究α-地贫HbH-CS和正常对照功能红细胞氧合及去氧能力。比较分析α-地贫HbH-CS和健康个体单个红细胞的氧循环过程的氧合及去氧能力及去氧态群体红细胞。结果发现,在氧循环的去氧态中,α-地贫HbH-CS的I1638/I1547显著高于正常对照;氧合态其I1638/I1547也略高于正常对照。群体统计中,若以小于正常对照I1638/I1547的平均值为去氧态基准,则正常对照46%的红细胞达到去氧态,而α-地贫HbH-CS的仅有15 %。表明,α-地贫HbH-CS红细胞的氧合能力较强,但去氧能力显著低于正常对照,而且α-地贫HbH-CS红细胞间的差异较大。该研究在单细胞水平上,揭示了α-地贫HbH-CS红细胞氧合、去氧能力以及细胞的差异性。