应激是机体对各种刺激所产生的一种非特异性应答反应。劣性应激可引起畜禽生产性能下降,诱发多种疾病,甚至造成死亡。寒冷是雏禽最普遍的应激原之一,由此引起的直接和间接经济损失是制约北方畜牧业发展的重要因素,研究动物冷应激发生机制,探索科学的应激监测方法,对提高应激预防水平,保障畜牧业发展有重要意义。冷应激对动物HPA和HPT轴为主的神经内分泌系统产生重要影响。然而未见冷应激对雏鹅HPA、HPT轴的影响及其相关基因表达调控的研究报道。本研究以7日龄皖西白鹅为试验对象,研究于12℃±1℃条件下进行急性冷应激处理时对HPA、HPT轴的影响。利用放射免疫法、FQ-RT-PCR等技术动态考察冷应激反应中血液生理生化指标、应激激素相关基因TRH、TSH、CRH、ACTH和HSP70基因mRNA的变化规律。同时采用RT-PCR技术克隆测序HSP70基因cDNA序列,并进行生物信息学分析。为深入研究动物冷应激机理,动物冷应激的早期监测和防治提供重要实验依据。研究主要取得如下成果：1.雏鹅受到冷应激时血相指标变化的测定结果以7日龄皖西白鹅为试验对象,研究于12℃±1℃条件下进行急性冷应激对皖西白鹅雏鹅某些血相指标变化的影响。研究结果表明,全血中红细胞(RBC)、红细胞压积(HCT)、血红蛋白(HGB)、红细胞分布宽度(RDW)总体呈减少趋势,且RBC在冷暴露3h、6h和冷暴露结束后0.5h和3h极显著低于冷应激前的水平；HCT和HGB在冷暴露3h、6h和冷暴露结束后3h时显著低于冷应激前的水平；RDW在冷暴露6h后至结束冷暴露后12h期间均极显著低于应激前水平(P<0.01)。白细胞(WBC)在冷暴露12h和24h时显著升高。淋巴细胞绝对值(LYM)在冷暴露6h时显著低于应激前的水平(P<0.05),淋巴细胞百分比(LYM%)在冷暴露后3h、6h和12h时显著升高(P<0.01),但冷应激24h时淋巴细胞百分比已经恢复正常,雏鹅已经开始适应。首次获得了皖西白鹅血液生理指标参考值,为兽医临床诊断与治疗提供了重要依据之一2.雏鹅冷应激时HPA、HPT轴应激激素测定的结果研究于12℃±1℃条件下进行急性冷应激处理时对雏鹅下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴和下丘脑-垂体-甲状腺(HPT)轴的影响。结果表明,FT3在冷暴露6h和12h时显著升高。FT4在冷暴露3h显著升高(P<0.01),随后逐渐下降,至结束冷暴露后12h显著降低(P<0.05)。T3在冷暴露过程中逐渐升高,在冷暴露6h和结束冷暴露后0.5h和3h时明显高于应激前水平。T4在冷暴露6h和结束冷暴露后6h时达到峰值。Cor在冷暴露3h时显著升高(P<0.05),并在冷暴露期间保持高水平。血清中ACTH随冷暴露时间延长而逐渐升高,在冷应激6h时显著高于应激前的水平(P<0.01),至冷暴露结束后3h时,ACTH再次明显升高(P<0.05)。ACTH、Cor和FT3反应敏感,初步认为它们可以作为评估冷应激程度的辅助指标。3.雏鹅冷应激反应中HPA、HPT轴应激激素相关基因表达调控规律采用RT-PCR技术对HPA、HPT轴应激激素相关基因TRH、TSH、CRH和ACTH克隆、测序,同源性比较,鹅TSH基因测序序列与GenBank上鹅TSH序列同源性为100%。鹅TRH、CRH、ACTH基因序列与GenBank上鸡TRH、CRH、ACTH基因序列同源性分别为94%、95%和95%。利用实时荧光定量逆转录PCR技术分析这些基因的表达调控规律。下丘脑TRH基因mRNA转录量在冷应激0.5h、3h、6h、9h、18h与应激结束后1h、6h和12h显著升高,其他时间内均下降到室温时的转录水平。垂体TSH基因nRNA转录量在冷应激1.5h到12h期间显著升高,应激12h时转录水平达到最高点,而其他应激时间均降低到应激前的水平,应激结束后1h到6h期间垂体TSH基因mRNA转录水平也被显著升高,冷处理结束后9h-24h已恢复到应激前的正常水平。下丘脑CRH基因nRNA转录量在冷应激3h、9h、18h时与应激结束后0.5h、1h和9h显著升高,其他时间点降到应激前的正常水平。肾上腺ACTH基因mRNA转录水平在冷应激1.5h-9h、18h时显著升高,其他时间点均迅速下降到应激前水平；冷处理结束后0.5h和3h,由于又突然受到热的室温应激,ACTH基因mRNA转录量又显著升高,其他时间点降到应激前的正常水平。下丘脑TRH基因mRNA表达呈现波动性变化趋势,但表达量均不超过1.5,说明下丘脑TRH基因是负调控的。下丘脑CRH、垂体TSH和肾上腺ACTH基因1nRNA的表达量分别在2.27-7.76、1.75-6.17、5.5-14.83范围内,总体呈上升趋势,说明TSH、CRH和ACTH基因均是冷应激反应时的正调控基因。4.鹅HSP70基因的克隆和生物信息学分析首次克隆了皖西白鹅HSP70基因cDNA序列2181bp,包括CDS全序列1905bp和3’UTR序列276bp,编码634个氨基酸。与GenBank上乌棕鹅HSP70基因cDNA序列进行比对分析,皖西白鹅HSP70基因共存在15个核苷酸变异(均在CDS区),只有1个蛋白质位点的差异,编码区同源性序列比对,与乌棕鹅同源性达99%,与家鸭、鸡、日本鹌鹑HSP70基因编码区同源性序列同源性分别达97%、92%和92%,与哺乳动物同源性均高于82%,进一步证实了HSP70在不同生物间的高度保守性。利用生物信息学预测鹅HSP70蛋白质的结构与功能,结果表明,HSP70蛋白质以亲水性区域为主；该蛋白具有丰富的B细胞抗原位点；抗原表位区域、柔韧性区域和表面可能性区域出现了较多的重叠区,这些区域相对易于形变,便于抗原、抗体的自由结合,可能是抗原位点的富集区；该蛋白二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,无明显的跨膜螺旋,含有34个磷酸化位点,无糖基化位点,推测其可能在细胞信号转导与调控中发挥重要作用。5.雏鹅冷应激反应中HPT、HPTA轴HSP70mRNA的动态表达规律实时荧光定量逆转录PCR法检测结果表明,下丘脑HSP70mRNA转录量在冷应激(12℃±1℃)1.5h、6h和9h显著升高,其他时间点均恢复到正常水平；在冷处理结束后6h内HSP70mRNA转录水平均显著升高,应激结束后6h转录水平最高,随后又迅速下降到室温下的转录水平。垂体HSP70mRNA转录量在冷应激0.5h、1.5h、6h和12h时显著降低,其他应激时间均升高到应激前的水平,应激结束后0.5h、3h和6h转录水平也被显著降低,随后逐渐升高到应激前的正常水平。甲状腺HSP70mRNA转录量在冷应激0.5h时显著升高,随后迅速下降到应激前的水平,应激3h、6h和12h时显著降低。应激结束后0.5h和3h转录量显著升高,其他时间点逐渐恢复到正常水平。肾上腺HSP70基因mRNA转录水平在冷应激1.5h、6h、9h时和冷处理结束后3h到6h期间表达水平被显著降低,其他应激时间恢复到应激前的水平。冷应激期间及结束冷处理后一段时间,肾上腺HSP70基因mRNA表达水平都很低,在0.02-0.57范围内,HSP70基因mRNA表达量仍然不超过1,推测HSP70基因也是肾上腺组织细胞表达的下调基因,是负调控的。雏鹅冷应激反应中,HSP70基因在下丘脑、垂体、甲状腺和肾上腺中的表达规律是不同的,在不同的组织中有不同的调控规律。下丘脑HSP70mRNA转录水平最高,表达量总体呈现明显上升趋势,是冷应激反应时的正调控基因：而它在垂体、甲状腺和肾上腺中的表达总体是被抑制的,是垂体、甲状腺和肾上腺冷应激反应时的负调控基因。初步认为可以将HSP70作为动物冷应激的分子生物标志。