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研究目的铁死亡是一种由铁离子依赖的,以脂质活性氧簇(Lipid ROS)累积、线粒体皱缩为主要标志的全新程序性细胞死亡方式。近年来的研究表明,诱导肿瘤细胞发生铁死亡是一种全新的肿瘤治疗策略,但目前铁死亡的调控机制尚未完全阐明,更缺乏基于铁死亡的抗肿瘤药物靶点发现的研究。作为细胞内重要的氧化还原蛋白,DJ-1在肺癌、肝癌等多种恶性肿瘤中高表达,且与不良预后高度正相关,提示其与肿瘤的发生发展密切相关。虽然目前的研究已经揭示DJ-1可通过直接或间接的多种方式清除细胞内水溶性活性氧簇(ROS),保护细胞免受氧化损伤,但DJ-1能否以及如何清除脂溶性的ROS并不清楚,更缺乏DJ-1调控铁死亡的作用研究。因此,本研究以铁死亡这一新细胞死亡方式作为切入点,明确DJ-1负性调控铁死亡的作用及其对抗肿瘤药物活性的影响,深入阐明DJ-1调控铁死亡的分子机制,并在此基础上开展抗肿瘤策略研究,力求为基于铁死亡的抗肿瘤治疗药物研发提供潜在靶点。研究方法:(1)DJ-1蛋白负性调控铁死亡的作用研究:采用慢病毒沉默体系、CRISPR/Cas9敲除体系和慢病毒过表达体系,分别构建DJ-1敲低、敲除和过表达的细胞株;采用C11-BODIPY染色结合流式细胞术,考察敲低、敲除及过表达DJ-1后对铁死亡应激下Lipid ROS累积的影响;采用CCK8(Cell counting kit-8)法考察敲低、敲除及过表达DJ-1后对铁死亡应激下细胞活力的影响;采用透射电镜考察敲低DJ-1对铁死亡应激下线粒体形态的影响;裸小鼠移植瘤模型考察敲低DJ-1对铁死亡诱导剂抗肿瘤作用的影响;采用免疫组化、TUNEL(Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling)染色考察敲低DJ-1对肿瘤组织中细胞增殖、细胞凋亡的影响;采用实时荧光定量多聚酶链式反应(Real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)和酶联免疫法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)考察敲低DJ-1对肿瘤组织中铁死亡的作用;采用RT-PCR考察敲低DJ-1对肿瘤细胞内铁代谢、脂质过氧化相关蛋白以及核因子E2相关因子NRF2(Nuclear factor E2 related factor 2)下游蛋白的转录水平影响;采用Western blot考察敲低DJ-1对肿瘤细胞内谷氨酸胱氨酸转运蛋白SLC7A11(Solute carrier family 7 member 11)和NRF2蛋白表达的影响;采用谷氨酸释放检测试剂盒考察敲低DJ-1对SLC7A11蛋白功能的影响;采用CCK8法考察敲低DJ-1对NRF2沉默加剧铁死亡的影响。(2)DJ-1蛋白负性调控铁死亡的分子机制研究:采用谷胱甘肽(Glutathione,GSH)试剂盒考察敲低DJ-1对铁死亡应激下肿瘤细胞内GSH含量的影响;采用Western blot考察DJ-1对GSH生物合成中γ-谷氨酸-半胱氨酸连接酶(γ-Glutamate-cysteine ligase,γ-GCS)和谷胱甘肽合成酶(Glutathione synthetase,GSS)蛋白表达的影响;采用C11-BODIPY染色结合流式细胞术和CCK8法考察外源性补入GSH、N乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-Cysteine,NAC)、甲硫氨酸(Methionine,Met)、S腺苷甲硫氨酸(S-Adenosylmethionine,SAM)、S腺苷同型半胱氨酸(S-Adenosylhomocysteine,SAH)、同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)对敲低DJ-1加剧铁死亡的影响;甲硫氨酸代谢流研究DJ-1调控铁死亡过程中关键中间代谢产物含量的变化;采用ELISA法检测敲低、敲除或过表达DJ-1对细胞内Hcy含量的影响;采用酶活检测试剂盒检测敲低或过表达DJ-1对S腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteine hydrolase,SAHH)酶活的影响;采用邻近蛋白标记技术研究DJ-1调控SAHH的潜在接头蛋白;采用免疫沉淀考察DJ-1对SAHH与S腺苷同型半胱氨酸水解酶样蛋白(Adenosylhomocysteinase like 1,AHCYL1)异源二聚体形成的影响;采用凝胶过滤层析技术和双琥珀酰亚胺辛二酸酯(Disuccinimidyl suberate,DSS)交联技术考察DJ-1对SAHH四聚体形成的影响;采用C11-BODIPY染色结合流式细胞术和CCK8法考察SAHH和AHCYL1在敲低DJ-1加剧铁死亡中的作用。(3)基于DJ-1蛋白二聚结构的抗肿瘤干预策略研究:采用免疫沉淀考察DJ-1蛋白同源二聚体形成情况;采用点突变结合DSS交联实验和排阻色谱法考察DJ-1的C端氨基酸对其二聚形成的影响;应用重组纯化蛋白研究二聚缺失型DJ-1的去糖化酶活情况;采用C11-BODIPY染色结合流式细胞术和磺酰罗丹明B(SRB)比色法考察二聚缺失型DJ-1对铁死亡的作用;设计合成二聚型DJ-1抑制剂并应用重组纯化蛋白研究其对DJ-1去糖化酶活的作用;采用C11-BODIPY染色结合流式细胞术和SRB法考察二聚型DJ-1抑制剂对铁死亡的作用。研究结果:(1)DJ-1蛋白负性调控铁死亡的作用研究:在多种肿瘤细胞株中,敲低DJ-1可显著加剧铁死亡诱导剂Erastin产生的Lipid ROS,并可显著增加Erastin引起的细胞死亡;在DJ-1敲除的小鼠成纤维细胞中,过表达野生型DJ-1可显著抑制铁死亡诱导剂Erastin产生的Lipid ROS,并可显著抑制铁死亡诱导剂Erastin引起的细胞死亡;敲低DJ-1显著增加铁死亡应激下,肿瘤细胞内皱缩线粒体的数目;裸小鼠移植瘤模型发现敲低DJ-1能显著增强铁死亡诱导剂哌嗪Erastin(Piperazine,PE)对肿瘤生长的抑制作用;敲低DJ-1显著增加肿瘤组织中铁死亡诱导剂PE产生的铁死亡诱导效应,但不会产生细胞增殖抑制和细胞凋亡诱导作用;肿瘤细胞中敲低DJ-1不影响铁代谢相关蛋白二价金属离子转运体蛋白(Ferrous ion membrane transport protein,DMT1),铁重链蛋白(Ferritin heavy chain 1,FTH1)和铁轻链蛋白(Ferritin light chain,FTL)的m RNA水平,也不影响脂质过氧化相关蛋白酰基辅酶A合成酶长链家族成员(Acyl-Co A synthetase long chain family member 4,ACSL4),溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(Acyl-Co A synthetase long chain family member 4,LPCTA3)和脂氧合酶(15-lipoxygenase,15-LOX)的m RNA水平;敲低肿瘤细胞中的DJ-1不影响SLC7A11的蛋白表达和功能;敲低肿瘤细胞中的DJ-1能进一步增加铁死亡诱导剂Erastin引起的NRF2蛋白的上调及其下游蛋白血红素氧化酶1(Heme oxygenase 1,HMOX1)m RNA水平的上调;敲低DJ-1能进一步增加NRF2沉默后Erastin引起的细胞死亡。(2)DJ-1蛋白负性调控铁死亡的分子机制研究:DJ-1通过抑制SAHH/AHCYL1异源二聚的形成,从而影响SAHH四聚和酶活,进而维持从甲硫氨酸到同型半胱氨酸的转硫途径,防止肿瘤细胞发生铁死亡;敲低或敲除DJ-1可显著抑制铁死亡应激下肿瘤细胞内GSH的含量;敲低DJ-1不影响GSH生物合成中γ-GCS和GSS蛋白含量的变化;外源性补入GSH、NAC和Hcy可完全逆转敲低DJ-1所加剧的铁死亡效应;代谢流组学发现敲低DJ-1可显著降低肿瘤细胞内Hcy的含量;敲低DJ-1可明显抑制SAHH酶活;过表达DJ-1可明显促进SAHH酶活;邻近蛋白标记技术发现AHCYL1等123个DJ-1新的结合蛋白;过表达DJ-1可明显减弱SAHH与AHCYL1异源二聚体的形成,而敲低细胞内的DJ-1可增强SAHH与AHCYL1的相互结合;敲低DJ-1可抑制SAHH四聚体的形成,而过表达DJ-1可促进SAHH四聚体的形成;在肿瘤细胞中过表达SAHH或敲低AHCYL1均能抑制敲低DJ-1所加剧的铁死亡效应。(3)基于DJ-1蛋白二聚结构的抗肿瘤干预策略研究:DJ-1存在同源二聚体,且C末端的3个氨基酸缺失后DJ-1蛋白的同源二聚化消失;二聚缺失型的DJ-1蛋白丧失了去糖化酶活;基于DJ-1二聚结构设计合成了6个DM系列化合物,发现DM系列化合物可不同程度地抑制DJ-1酶活,其中DM10的抑制作用最强;DM10特异性靶向同源二聚化的DJ-1蛋白;二聚型DJ-1抑制剂DM10可显著促进细胞发生铁死亡。研究结论:本研究发现了氧化还原蛋白DJ-1在负性调控铁死亡中的重要作用。机制上,DJ-1可以与AHCYL1发生相互作用,抑制SAHH-AHCYL1异源二聚体的形成,维持四聚体SAHH的酶活,促进转硫途径中同型半胱胺酸的合成。干预DJ-1调控的转硫代谢途径可在体内外显著促进铁死亡应激条件下的抗肿瘤作用。同源二聚化是DJ-1蛋白发挥负性调控铁死亡的结构基础,通过设计合成DM10等系列化合物,可特异性靶向同源二聚化DJ-1,抑制DJ-1去糖化酶活并显著增强铁死亡诱导剂的抗肿瘤疗效。