论文部分内容阅读
据统计,脑胶质瘤约占脑部肿瘤的30～40%,而传统的手术治疗、放疗或化疗并不能取得理想的治疗效果,因此,探寻新的治疗方法成为脑胶质瘤的研究重点。细胞凋亡在胚胎发育与组织分化中起着关键作用,细胞凋亡失调对肿瘤的发生、发展甚为重要,其存在细胞内与细胞外两条途径。化疗药物盐酸阿霉素(Doxorubicin, DOX)通过细胞内途径促进肿瘤细胞凋亡；而肿瘤坏死因子家族成员TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand)主要通过细胞外途径促进肿瘤细胞凋亡。本课题以DOX与TRAIL为治疗药物,采用长循环脂质体作为药物载体,制备复方脂质体(TRAIL-LP/DOX-LP),以期同时通过细胞内途径与细胞外途径,发挥两种药物的协同抗肿瘤作用,延长药物的体内滞留时间,并利用肿瘤的EPR效应增加药物在肿瘤部位的蓄积,促进肿瘤细胞的凋亡,增强抗肿瘤效果。本文第一章为复方TRAIL/DOX溶液剂的协同抗肿瘤作用研究。以对TRAIL不敏感的人脑胶质瘤细胞U87为研究对象,考察了TRAIL与DOX合用的协同增效作用,并对其体内抗U87脑胶质瘤的药效学进行了初步探索。结果表明,DOX与TRAIL溶液剂在体外具有良好的协同增效作用,而在体内并不能显著改善荷脑胶质瘤动物模型的存活时间,提示TRAIL与DOX若要在体内发挥协同作用,可能需要纳米给药系统的辅助。另外,为了验证TRAIL与DOX协同增效作用的普适意义,对其协同抗非小细胞肺癌的作用也进行了体内外评价。第二章为TRAIL-LP/DOX-LP的制备与表征,并对其被动靶向脑胶质瘤的特性进行了考察。以硫酸铵水化法制备阿霉素脂质体(DOX-LP)。DOX-LP的平均粒径为101.0±45.3nm,包封率为97.4%,Zeta电位为-5.74mV。在课题组前期考察了超声、冻融以及温度对于TRAIL活性影响的基础上,以薄膜水化法制备TRAIL脂质体(TRAIL-LP), TRAIL-LP的平均粒径为107.6±47.8nm,包封率为12.5%,Zeta电位为-2.09mV。采用小动物活体成像技术考察了脂质体在荷瘤鼠体内的分布,结果表明,包载近红外探针DiR的脂质体(DiR-LP)能够入脑并在肿瘤部位浓集,具有一定的脑肿瘤靶向特性。第三章考察了TRAIL-LP/DOX-LP对脑胶质瘤的体内外药效学,并对其体内外安全性进行了初步评估。以人脑胶质瘤U87细胞为模型,初步考察了复方脂质体的体外抗肿瘤活性,结果表明,TRAIL-LP/DOX-LP对U87细胞的杀伤作用显著增强,提示复方脂质体在体外具有较好的协同促脑胶质瘤细胞凋亡作用；通过测量给药后荷瘤鼠肿瘤体积大小,体内胶质瘤细胞的凋亡率,以及荷瘤鼠的生存曲线和中位生存期,评价了复方脂质体对脑胶质瘤的体内药效。结果表明,TRAIL-LP/DOX-LP组治疗后,瘤体积为6.73±1.79mm3,和生理盐水组瘤体积64.82±4.26mm3,TRAIL-LP组瘤体积61.53±12.26mm3以及DOX-LP组瘤体积25.59±6.31mm3相比,均有显著性减小(p<0.01)；流式细胞仪检测TRAIL-LP/DOX-LP组脑胶质瘤区的细胞凋亡率为19.92±2.49%,也显著高于生理盐水组(5.40±1.38%)、TRAIL-LP组(7.80±0.30%)以及DOX-LP组(9.32±1.23%)(p<0.02)；与生理盐水组相比较,TRAIL-LP/DOX-LP组的中位生存期延长了50%,而TRAIL-LP组无延长,DOX-LP组仅延长了21.9%。以正常细胞大鼠脑毛细血管内皮细胞(BCEC)为模型考察复方脂质体的体外毒性,结果表明,TRAIL-LP/DOX-LP对BCEC几乎没有抑制增强作用；而采用H&E染色各组织切片的方法考察TRAIL/DOX-LP的体内毒性,结果显示TRAIL-LP/DOX-LP在体内也具有较好的安全性。第四章对TRAIL-LP/DOX-LP的协同抗脑胶质瘤的机理进行了体内外研究。体外研究考察了DOX-LP对U87细胞DR4(death receptor4)与DR5(death receptor5)表达总量及其细胞表面表达量的影响；另外,也考察了TRAIL-LP/DOX-LP对U87细胞中caspase家族蛋白以及Bcl家族蛋白表达的影响。研究结果表明,DOX能够增加U87细胞表面DR4与DR5受体的表达量,提示其可以为TRAIL创造更多的与DR4、DR5结合的机会,从而增强TRAIL促肿瘤细胞凋亡的作用；在细胞内途径中起重要作用的caspase-9前体以及在细胞外途径中起重要作用的caspase-8前体的表达的降低,以及在细胞内途径与细胞外途径中共同起作用的关键调节蛋白caspase-3的活性体表达的增加,提示caspase-9前体与caspase-8前体可能降解为发挥细胞凋亡作用的活性体,表明复方脂质体的协同抗肿瘤作用是细胞内途径与细胞外途径共同增强的结果。体内研究对给药后的荷瘤鼠脑胶质瘤部位的冰冻切片进行免疫荧光染色,考察DR4以及DR5的表达。结果表明,复方脂质体能够增加DR5的表达,而对DR4表达无显著影响,进一步说明DOX能够通过增加肿瘤细胞表面DR5受体的表达,增强TRAIL与其结合的能力,并最终增加促肿瘤细胞凋亡的关键分子caspase-3的表达而促进肿瘤细胞的凋亡。