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背景与目的脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是一种严重的中枢神经系统的损伤,是目前公认的疑难病之一,它具有致残率高、医疗耗费高等特点,既严重威胁了患者的健康,同时也极大影响了患者的生活质量,给家庭以及社会带来了沉重的经济负担。流行病学研究表明,中国每年大约有10万名患者。SCI后常常伴随着疼痛的发生,国际规定将SCI后疼痛分为感受性疼痛,神经性疼痛以及其它疼痛,其中感受性疼痛发病率为50%,神经性疼痛发病率为59%。在所有的类型的疼痛中,神经病理性痛(Neuropathic Pain,NP)最常见也最难治愈,药物是脊髓损伤后神经病理性痛(Neuropathic Pain After Spinal Crod Injury,SCI-NP)目前主要的治疗方法,但是副作用大,大约只有1/3的患者能减轻50%的疼痛。近年来,以骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)为代表的成体干细胞移植治疗SCI被给予了厚望,并在临床得到了初步应用,而MSCs对SCI-NP的影响研究甚少且存在争议,因此研究MSCs移植对SCI-NP的影响以及如果去影响就显得尤为必要。国内外部分研究表明,SCI后移植MSCs可以缓解机械性痛和热痛敏,阻止慢性痛的产生和发展。然而干细胞移植对缓解疼痛的效果也一直存在争议。Hofstetter等将野生型的NSCs移植SCI-NP大鼠时发现移植后大鼠运动功能提高的同时,其前肢出现痛觉超敏。因此深入探讨MSCs移植对SCI-NP的影响,以及其发挥作用的分子机制是本实验研究的主旨。Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)是一种模式识别受体目前已经证明与免疫性或炎症性疾病有着密切的关系,其激活后可通过调控NF-κB信号途径生成并释放大量的促炎因子。研究表明,在中枢神经系统,TLR4主要表达在小胶质细胞,参与小胶质细胞的活化,并在中枢免疫炎症过程中起着重要的作用,Sorge RE等表明,TLR4与炎性痛以及NP密切相关。MSCs被誉为对抗过度炎性反应的“监护人”,那么MSCs移植SCI-NP是否能够通过降低TLR4的表达,从而减轻SCI后慢性炎症和损伤所导致的痛觉过敏,目前仍未见报道,因此,本研究首先通过meta分析,评价MSCs移植对SCI-NP的影响,并在此基础上,通过在损伤处原位移植MSCs,观察移植前后SCI-NP模型大鼠组织学、行为学变化的规律,评估其移植缓解疼痛的效果,探讨MSCs移植缓解SCI-NP大鼠疼痛的机制,为SCI-NP的MSCs移植治疗提供理论依据和实验基础。方法1.以"MSCs","Spinal cord injury"和"Neuropathic pain"为关键词,搜索文献,通过meta分析对MSCs对SCI-NP的影响进行评价,分析课题的可行性;2.设立100kdynes,150kdynes,180kdynes,200kdynes四组不同的打击力度,于术前1d,术后7d、14d、21d和28d检测大鼠机械痛阈的变化,同时在术前1d,术后1d、3d、5d、7d、14d、21d和28d检测大鼠BBB评分以及斜板实验的变化,确定最佳打击力度;3.以最佳打击力度建立SCI-NP模型,于术前1d,术后7d、14d、21d和28d检测大鼠机械痛阈的变化,同时检测术前1d,术后1d、3d、5d、7d、14d、21d和28d大鼠BBB评分和斜板实验的变化,免疫荧光(immunofluorescence,IF)和免疫印迹实验(Western blot,WB)检测SCI后胶质细胞激活以及TLR4、My D88、p-p38和p-NF-κB p65等相关分子表达的变化。ELISA检测细胞因子IL-6和TNF-α表达的变化,HE染色和髓鞘染色检测损伤处组织病理学改变;4.体外培养SD大鼠原代MSCs,并取P2代细胞,通过流式细胞术鉴定其表面抗原CD34,CD45,CD44,CD90的表达,对原代培养的MSCs进行鉴定;5.建立SCI-NP模型,并于术后7d,原位移植MSCs,检测移植前后大鼠机械痛阈及运动功能的变化,并通过IF检测小胶质细胞激活情况,WB检测TLR4、My D88、p-p38和p-NF-κB p65等分子表达的变化。ELISA检测细胞因子IL-6和TNF-α表达的变化。结果1.Meta分析的结果显示,MSCs移植能够缓解SCI后的机械痛敏,但是对热痛敏无缓解作用,MSCs移植的最佳时间点为SCI后7d。2.打击力度的摸索结果显示,以100kdynes和150kdynes的打击力度建模,均未能产生NP,而以180kdynes和200kdynes的打击力度建模,均能够产生NP,但200kdynes的打击力度建模,机械痛阈下降的时间比180kdynes早,BBB评分以及斜板实验的结果显示,两种打击力度建模,其运动功能并无明显的差异,因此200kdynes为最佳打击力度,并为后续实验所用的打击力度。3.以200kdynes打击力度建模后,大鼠双后肢的机械痛阈在7d时即出现明显的下降,21d后逐渐稳定,疼痛的持续时间超过28d。BBB评分结果显示,SCI后1d大鼠BBB评分为下降为0,随着损伤的进程,运动功能逐渐恢复,BBB评分逐渐升高,于14d逐渐达到稳定,但仍不能恢复到正常值。斜板实验结果显示,SCI后,大鼠的支撑角度明显下调,随着损伤的进程,逐渐恢复,但仍不能恢复到正常值。4.SCI后24h,损伤处受压变形,局部充血,伴随着损伤进程,大量炎性细胞浸润,并伴有脊髓空洞和脱髓鞘的发生。损伤处星形胶质细胞和小胶质细胞激活,且小胶质细胞中TLR4,My D88,p-p38,p-NF-κBp65表达上调;血清中IL-6和TNF-α的水平在24h即开始上调,持续时间超过28d。5.体外原代培养MSCs,流式细胞术结果显示,所培养的细胞细胞CD90,CD44表达为阳性,阳性率分别为99.7%和86.5%;CD34,CD45表达为阴性,证明所培养细胞为MSCs。6.术后7d移植MSCs结果显示,MSCs移植后,与Vehicle组相比,大鼠双后肢机械痛有明显的缓解。而BBB评分和斜板实验结果显示,MSCs移植在短期内对运动功能无影响;分子实验结果显示,MSCs移植后TLR4,My D88,p-p38,p-NF-κB p65的表达明显下调,同时血清中IL-6和TNF-α表达下调。结论MSCs移植能够通过抑制TLR4/My D88信号通路,下调IL-6和TNF-α的表达,减轻神经炎症从而缓解SCI-NP。