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近年来,随着肿瘤患者生存率的提高,化疗药物所致医源性损害逐渐得到重视。化疗药物对卵巢组织具有细胞毒性,可引起卵巢功能不全,使得年轻女性患者提早出现更年期综合征,导致不孕,严重影响她们的生活质量和自信心。促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing-Hormone GnRH)类似物通过抑制女性性腺轴,可减少化疗对原始卵泡的损害,对卵巢起到保护作用。促性腺激素释放激素拮抗剂(Gonadotropin releasing Hormone Antagonist GnRHant)作为GnRH类似物的衍生物之一,对女性性腺轴有较强抑制作用,且副作用、剂量及用药时间均小于GnRH激动剂,是理想的替代GnRH激动剂的治疗药。国外多项研究都证明GnRH拮抗剂对卵巢功能具有明显的保护作用,而国内尚缺乏相关的基础与临床研究。本课题旨在通过构建卵巢功能早衰(Premature overy failure POF)大鼠模型进一步探讨GnRH拮抗剂在化疗中对卵巢功能的保护作用及可能的机制,为其应用于临床寻求一定的理论依据。第一部分化疗损伤性卵巢功能早衰大鼠动物模型的构建选用50只2-3月龄雌性SD大鼠,随机将其分为空白对照组,环磷酰胺(Cytoxan CTX)阳性对照组,依托泊苷(Etoposide VP16)低、中、高剂量组,每组10只。VP16低、中、高组的剂量分别为1、3和5mg/(kg·d),空白对照组采用0.9%生理盐水1mL/d,CTX20mg/kg.d,5组动物均连续腹腔注射给药10d。用药后比较5组大鼠体重、双侧卵巢湿重、子宫湿重、卵泡数和卵巢组织结构的变化;采用酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbant assay ELISA)方法测定5组大鼠血清促卵泡素(Folliclest imulating hormone FSH)和雌二醇(Estradiol E2)水平。结果提示:Vp16给药后,发现大鼠卵巢组织破坏和卵泡数减少程度与用药剂量有关,VP16高、中剂量组卵泡总数明显减少,主要是大、中卵泡;卵巢皮质有不同程度的纤维化,导致卵泡闭锁及颗粒细胞不能分泌雌、孕激素,进一步干扰下丘脑-垂体-卵巢轴(Hypothalamic-pituitary-ovarian axis HPOA),从而性激素合成、分泌紊乱,表现出FSH水平升高,E2水平下降,这与以往所报道的人体卵巢毒性结果基本相符。VP16 3mg/(kg.d)实验剂量最符合POF主要临床内分泌检验特征,即低雌激素血症和高促性腺激素血症,而动物正常的代谢机能基本保持正常。该模型成模时间短,卵巢组织学、内分泌学改变与人类POF极为相符,为进一步实验奠定基础。第二部分探讨西曲瑞克对化疗大鼠卵巢保护作用及机制实验一探讨西曲瑞克对化疗大鼠卵巢保护作用选用60只2-3月龄雌性SD大鼠,随机将其分为空白对照组,GnRH拮抗剂(西曲瑞克)组, CTX组, VP16组,西曲瑞克+CTX组,西曲瑞克+VP16组,每组10只。用药结束后比较6组大鼠体重、卵巢湿重、子宫湿重、卵泡数和卵巢组织结构的变化;采用ELISA法测定6组大鼠血清FSHE2水平。通过对卵巢组织切片显微镜下观察、显微镜下计数卵泡等技术对各级卵泡进行定性及定量分析,ELISA法测定血清性激素,来明确西曲瑞克对化疗中卵巢的保护作用。结果提示:1. CTX和VP16均导致大鼠体重、卵巢和子宫湿重减轻,卵巢组织出血,坏死,纤维化,卵泡总数显著减少,尤其是生长卵泡和成熟卵泡,提示化疗药的卵巢毒性可能在于破坏有丝分裂活跃的细胞,使成熟卵泡减少,处于静止期的卵泡免受损害。而西曲瑞克和西曲瑞克联合用药保护组卵巢组织纤维化程度较化疗药物组减轻,无明显出血、坏死、卵泡闭锁及成熟卵泡数减少,初级卵泡数目比例升高,总的卵泡数与对照组无明显差异。由此可知GnRH拮抗剂能够保存大部分初级卵泡,处于静止期的卵泡可免受化疗药损害,减低化疗药物对大鼠卵巢组织的损害,从而保护卵巢的储备功能。2. FSH和E2可间接反映卵巢储备功能。化疗药物使卵巢皮质有不同程度的纤维化,卵泡闭锁,颗粒细胞不能分泌雌、孕激素,进一步干扰HPOA,从而性激素合成、分泌紊乱,表现血清FSH水平的升高,E2水平的下降。本研究的结果显示,在CTX组和VP16组大鼠中,FSH浓度明显升高,E2水平明显下降,而西曲瑞克联合治疗组中,大鼠血清E2和FSH浓度与空白对照组没有显著性差异。这说明单用化疗药对卵巢功能有明显损伤,联用GnRH拮抗剂后,大鼠的卵巢储备明显高于单用化疗药,GnRH拮抗剂有效阻止了化疗所致的卵巢储备功能下降。实验二探讨西曲瑞克对化疗中卵巢的保护机制化疗促进卵细胞调亡,近年研究热点在化疗所致卵细胞凋亡的信号途径上,结果提示:1. TdT介导的dUTP的缺口末端标记(TUNEL)技术检测各用药组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡情况,凋亡指数(Apoptotic index AI)的计算:计数1000个细胞中TUNEL阳性细胞所占百分比。结果表明西曲瑞克组和西曲瑞克联合用药组的AI远远小于化疗组。2.通过链霉素抗生物素-过氧化物酶(Strepavidin-peroxidaae SP)免疫组化方法检测B细胞淋巴瘤/白血病-2 (B-cell lymphoma/leukemia-2 Bcl-2)蛋白、半胱天冬酶-3(Caspase-3 CP-3)蛋白在卵泡颗粒细胞中的表达水平,结果显示,与对照组、西曲瑞克组和联合用药组相比,CTX组和VP16组Bcl-2表达降低,caspase-3表达升高。凋亡指数与caspase-3表达呈正相关,与Bcl-2的表达呈负相关。由此表明:降低卵巢颗粒细胞caspase-3表达并使Bcl-2蛋白表达升高,抑制卵细胞凋亡可能是GnRH拮抗剂保护化疗中卵巢的分子机制之一。3.通过SP免疫组化方法检测雌激素受体(Estrogen receptor ER),孕激素受体(Progesterone receptor PR)在卵巢间质中的表达水平,结果表明西曲瑞克并不改变大鼠卵巢组织中ER、PR的表达,至少说明在该用药水平和周期下西曲瑞克不通过改变大鼠卵巢组织中ER、PR表达对卵巢起到保护作用。综上所述,GnRH拮抗剂能够降低化疗药物对大鼠卵巢的损伤,起到抗凋亡作用,从而保护大鼠卵巢储备功能,作用机制可能为抑制凋亡因子caspase-3表达而激活抗凋亡因子Bcl-2表达。