背景乳腺癌是目前全世界妇女面临最为常见的癌症,其发病率、病死率高,严重危害妇女身心健康。乳腺癌目前以手术、放疗、化疗、内分泌治疗及分子靶向治疗等综合治疗为主,使部分患者得以救治或缓解。但还有一部分患者发现时已属晚期、错过手术时机、放化疗副作用大、不同程度耐药、复发转移等问题,严重影响了乳腺癌患者的生存质量和生存期。越来越多的学者将目光聚焦于中医药,开展大量临床观察和基础研究,并取得了一定进展,体现出中医药治疗乳腺癌在提高机体免疫力、放化疗增效减毒、逆转耐药、改善生存质量、降低复发转移、延长生存期等方面的优势。浙贝母、土贝母是乳腺癌中医治疗的常用中药,尤其在术后、放化疗后的长期调理维持治疗过程中,具有应用价值。前期研究工作致力于土贝母抗乳腺癌的疗效评价,以及浙贝母逆转乳腺癌耐药性的研究开发,均取得了很好的疗效。但将二者联合用于乳腺癌的研究尚未展开。临床上有土贝母、浙贝母配伍组方联合应用于晚期乳腺癌的报道。导师临床经验也多以药对“土贝母-浙贝母”配伍应用治疗乳腺癌,但其有效性尚缺乏系统评价。目的通过体外与体内实验,研究药对“土贝母-浙贝母”抗乳腺癌疗效。为中医临床配伍使用“土贝母-浙贝母”治疗乳腺癌,提供客观实验依据。方法设计体外与体内实验,研究药对“土贝母-浙贝母”抗乳腺癌的疗效。1.体外实验：定性观察与定量检测相结合。运用MTT法考察药对“土贝母-浙贝母”对四种不同生物学特性的人乳腺癌细胞增殖的影响；建立双色荧光蛋白转染的四种人乳腺癌细胞株模型MDA-MB-231 DUAL, BT-549 DUAL, MCF-7 DUAL,及MCF-7/ADR-RES DUAL。运用荧光显微镜,观察细胞在药对“土贝母-浙贝母”作用下的形态学变化特点。2.体内实验：应用外科原位移植办法,建立绿色荧光蛋白标记的人乳腺癌(MDA-MB-231-GFP)裸鼠模型,通过设置阴性对照组、土贝母组、双贝母低剂量组及双贝母高剂量组,给药8周,以FluorVivo Model 100荧光成像仪对裸鼠进行动态活体成像,观察肿瘤体内增殖实时状况。实验结束后,比较不同组间肿瘤重量、转移情况、肿瘤组织细胞凋亡与周期的差异,以探讨药对“土贝母-浙贝母“体内抗乳腺癌疗效。结果1.土贝母单独应用对乳腺癌细胞都有抑制增殖的作用。浙贝母单独作用对乳腺癌细胞增殖影响不大。除MDA-MB-231细胞系,其余三种乳腺癌细胞在相同土贝母作用浓度下,加入浙贝母可以提高抑制率(P<0.05),药对“土贝母-浙贝母”抗乳腺癌细胞增殖具有协同作用。2.土贝母单独作用时,对三阴性乳腺癌BT-549、MDA-MB-231抑制作用更强。而对激素受体阳性的耐药细胞株MCF-7/ADR-RES敏感性不高。浙贝母单独作用对不同生物学特性的乳腺细胞株均影响不大。当土贝母与浙贝母共同作用时,对三阴性高转移性MDA-MB-231细胞敏感性最差。对于三阴株BT-549、受体阳性株MCF-7,浙贝母可以增加两种细胞对土贝母的敏感性,二者具有协同作用。对于耐药细胞株MCF-7/ADR-RES,浙贝母可以逆转耐药、增加细胞对土贝母的敏感性,二者具有协同作用。汉防己甲素作为浙贝母的阳性对照,发现MCF-7、MCF-7/ADR-RES敏感,而BT-549、MDA-MB-231细胞不敏感。提示汉防己甲素与浙贝母尽管都可以逆转MCF-7/ADR-RES的耐药,但作用机制可能不同。3.成功建立双色荧光蛋白转染的四种人乳腺癌细胞株MDA-MB-231 DUAL, BT-549 DUAL, MCF-7 DUAL,及MCF-7/ADR-RES DUAL。经药对“土贝母-浙贝母”作用后,形态学可观察到细胞凋亡和胀亡现象。4.成功建立绿色荧光蛋白标记的人乳腺癌裸鼠模型(MDA-MB-231-GFP)。体内实验结束时,各组小鼠体重均增加,一般状况良好。土贝母组、双贝母低剂量组、双贝母高剂量组较阴性对照组肿瘤面积减小,差异有统计学意义(P<0.05)。土贝母组、双贝母低剂量组和双贝母高剂量组,与阴性对照组比较,肿瘤重量均有减少,肿瘤抑制率分别为14%、35%和19%,但组间没有统计学差异(P>0.05)。解剖主要脏器后进行荧光成像,显示各组小鼠均可见到肺及淋巴结转移,肺转移以土贝母组最少,淋巴结转移以土贝母组、双贝母低剂量组较少。肿瘤组织凋亡结果显示早期凋亡各组间无明显差异；中晚期凋亡以双贝母高组比例高于阴性对照组,差异显著(P<0.05)；双贝母高、低剂量组较阴性对照组早期+中晚期凋亡细胞数量增多,而正常细胞比例减少,具有统计学意义(P<0.05)。细胞周期检测则未见明显差异(P>0.05)。5.实验结束时,各组小鼠整体上体重均增加,—般状况良好,阴性对照组与各治疗组小鼠实验结束时体重比较无显著差异。解剖各重要脏器,未见明显出血、变性、坏死等表现。提示小鼠对目前实验中所用剂量的土贝母和浙贝母提取物联合用药无明显的急性毒性反应。但治疗前后T20+Z15组小鼠体重的增加要明显低于CON组(P<0.05)。结合治疗后瘤重组间比较无显著差异,推测土贝母与浙贝母长期联合应用会延缓小鼠体重增加。实验过程中,双贝母高、低剂量组均有小鼠中途死亡,而阴性对照及土贝母组小鼠均正常存活至实验结束,提示土贝母与浙贝母联合应用,具有—定的毒性。结论1.药对“土贝母-浙贝母”在体外对乳腺癌细胞的增殖抑制具有协同作用,浙贝母可以提高土贝母抗乳腺癌疗效。药对“土贝母-浙贝母”诱导乳腺癌细胞死亡的方式包括凋亡和胀亡。2.药对“土贝母-浙贝母”对不同生物学特性的乳腺癌细胞敏感性不同,其中对高转移性三阴性细胞株MDA-MB-231敏感性最低,而对耐药细胞株MCF-7/ADR-RES疗效最为显著。3.药对“土贝母-浙贝母”应用于人类乳腺癌MDA-MB-231 GFP裸鼠模型显示出抑制乳腺癌生长的可能,但体内长期应用具有一定毒性。