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研究背景CXCL12/CXCR4生物学轴是指由趋化因子CXCL12与其特异性受体CXCR4相互作用而构成的一个与细胞间信息传递、细胞迁移有密切关系的偶联分子对,其实质在于CXCR4对其配体CXCL12的高度亲和力和绝对特异性,即CXCR4作为CXCL12的专属受体而存在。CXCL12/CXCR4生物学轴不仅参与白细胞浸润、细胞迁移和器官发育等一系列重要的生理过程,在肿瘤的局部侵袭和器官特异性转移中具有重要作用,包括乳腺癌、肝癌、基底细胞癌等。表遗传机制可以导致基因失活,通过抑癌基因表达缺失,参与肿瘤的发生和发展。在哺乳动物细胞中,最重要的表遗传机制是DNA甲基化。在CXCL12基因5′的转录起始区有一个典型的CpG岛区,该区域缺乏一个真正的TATA调控区,提示CXCL12基因启动子区甲基化可能参与基因转录水平的调节。在哺乳动物中,DNA的甲基化主要通过DNA甲基转移酶DNMT1,DNMT3A和DNMT3B来建立和维持,这三种酶之间存在着协同作用。研究目的研究趋化因子CXCL12及其受体CXCR4在星形细胞瘤和乳腺癌组织中的表达与肿瘤恶性程度之间的关系;初步探讨CXCL12基因的启动子区DNA甲基化与mRNA表达变化的内在因果联系;探讨DNA甲基转移酶的表达与DNA异常甲基化之间的关系;分析DNA甲基化在CXCL12/CXCR4生物轴参与星形细胞瘤和乳腺癌恶性进展中的调控机制。研究方法（一）星形细胞瘤中DNA甲基化对CXCL12/CXCR4生物学轴的基因调控1.临床收集76例脑星形细胞瘤（WHO分级:Ⅱ级20例,Ⅲ级26例,Ⅳ级30例）和10例正常脑组织标本,收集患者的临床和病理资料。2.传统的逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和实时定量PCR方法（SYBR GreenReal-time PCR）,检测CXCL12、CXCR4 mRNA在星形细胞瘤和正常脑组织中的表达情况。采用Kruskal-Wallis检验、Mann-Whitney检验等统计学方法分析CXCL12、CXCR4 mRNA表达与肿瘤病理组织分级、患者性别和年龄等临床参数间的关系。3.DNA经亚硫酸氢钠修饰后,甲基化特异性PCR（methylation specific PCR,MSP）方法,检测CXCL12基因在星形细胞瘤和正常脑组织中的DNA甲基化发生情况。采用卡方检验分析CXCL12基因甲基化与肿瘤病理组织分级、患者性别和年龄等临床参数间的关系;另外分析CXCL12基因甲基化与CXCL12 mRNA表达之间的关系。4.传统的逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和实时定量PCR方法（SYBR GreenReal-time PCR）,检测DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B基因在星形细胞瘤和正常脑组织中的mRNA表达情况。采用Spearman秩相关系数检验分析DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表达相互之间的相关性;另外分析DNA甲基转移酶（DNMTs）表达与CXCL12基因甲基化的关系。（二）乳腺癌中DNA甲基化对CXCL12/CXCR4生物学轴的基因调控1.临床收集63例乳腺癌标本（TNM分期:Ⅰ期9例,ⅡA期25例,ⅡB期13例,ⅢA期16例）和20例正常乳腺组织标本,收集患者的临床和病理资料。2.免疫组织化学染色-SP法,检测ER、PR、Her-2、p53和Ki-67蛋白在乳腺癌和正常乳腺组织中的表达情况。3.传统的逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和实时定量PCR方法（SYBR GreenReal-time PCR）,检测CXCL12、CXCR4 mRNA在乳腺癌和正常乳腺组织中的表达情况。采用Kruskal-Wallis检验、Mann-Whitney检验等统计学方法分析CXCL12、CXCR4 mRNA表达在不同年龄、绝经情况、淋巴结转移、组织学分级、病理类型、肿瘤大小以及不同免疫组化指标（ER、PR、Her-2、p53和Ki-67）等临床参数间的关系。4.DNA经亚硫酸氢钠修饰后,甲基化特异性PCR（methylation specific PCR,MSP）方法,检测CXCL12基因在乳腺癌和正常乳腺组织中的DNA甲基化发生情况。采用卡方检验分析CXCL12基因甲基化在不同年龄、绝经情况、淋巴结转移、组织学分级、病理类型、肿瘤大小以及不同免疫组化指标（ER、PR、Her-2、p53和Ki-67）等临床参数间的关系;另外分析CXCL12基因甲基化与CXCL12mRNA表达之间的关系。5.传统的逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和实时定量PCR方法（SYBR GreenReal-time PCR）,检测DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B基因在乳腺癌和正常乳腺组织中的mRNA表达情况。采用Spearman秩相关系数检验分析DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表达相互之间的相关性;另外分析DNA甲基转移酶（DNMTs）表达与CXCL12基因甲基化的关系。6.免疫组织化学染色-SP法,检测CXCL12、CXCR4蛋白在乳腺癌和正常乳腺组织中的表达情况。采用卡方检验分析CXCL12、CXCR4蛋白在不同年龄、绝经情况、淋巴结转移、组织学分级、病理类型、肿瘤大小以及不同免疫组化指标（ER、PR、Her-2、p53和Ki-67）等临床参数间的关系;另外分析CXCL12蛋白表达与CXCL12基因甲基化之间的关系。研究结果（一）星形细胞瘤中DNA甲基化对CXCL12/CXCR4生物学轴的基因调控1.实时定量RT-PCR结果显示,星形细胞瘤标本CXCR4 mRNA表达量（6.00±4.77）高于正常脑组织(0.53±0.24,P＜10-7)。CXCR4 mRNA表达量与组织分级呈正相关(P=1.2×10-5)。CXCR4 mRNA在不同性别、不同年龄组间的差异均无统计学意义（P＞0.05）。2.实时定量RT-PCR检测CXCL12 mRNA在16例（21.1%）星形细胞瘤表达下调或缺失（均为Ⅱ级）,在47例（61.8%）星形细胞瘤表达上调（Ⅲ级20例,Ⅳ级27例）。CXCL12 mRNA在Ⅳ级星形细胞瘤的表达（7.88±6.12）高于正常脑组织(1.86±0.62,P=4.74×10-5)。Ⅱ级和Ⅲ级星形细胞瘤CXCL12 mRNA表达,与正常脑组织之间的差异无统计学意义（P值分别为0.534、0.113）。另外,CXCL12 mRNA在不同性别、不同年龄组间的差异均无统计学意义（P＞0.05）。3.CXCL12基因在星形细胞瘤中的DNA甲基化率为34.2%。在26例发生甲基化星形细胞瘤中,21例是不完全甲基化,5例是完全甲基化。所有10例正常脑组织中均未检测到CXCL12基因甲基化。CXCL12基因在Ⅱ级星形细胞瘤的甲基化率为55.0%（11/20）,Ⅲ级为34.6%（9/26）,Ⅳ级为20.0%（6/30）。CXCL12基因甲基化率与星形细胞瘤WHO分级呈负相关(r=-1,P=10-6)。CXCL12基因甲基化在不同性别、不同年龄组间的差异均无统计学意义（P＞0.05）。在Ⅱ级和Ⅲ级星形细胞瘤中,CXCL12基因发生甲基化的星形细胞瘤样本中的mRNA的表达水平低于未发生甲基化的星形细胞瘤样本（P=0.001）。但在Ⅳ级星形细胞瘤中,CXCL12 mRNA表达量在CXCL12基因发生甲基化与未发生甲基化的星形细胞瘤样本间的差异无统计学意义（P=0.550）。4.实时定量RT-PCR结果显示,在星形细胞瘤中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B基因表达相互之间呈正相关,DNMT1和DNMT3A（r=+0.344,P=0.002）、DNMT1和DNMT3B（r=+0.389,P=0.001）、DNMT3A和DNMT3B（r=+0.305,P=0.007）。DNMT1、DNMT3A和DNMT3B基因在CXCL12发生甲基化的星形细胞瘤表达均高于CXCL12未发生甲基化的星形细胞瘤（P值分别为0.025、0.003、0.043）。（二）乳腺癌中DNA甲基化对CXCL12/CXCR4生物学轴的基因调控1.实时定量RT-PCR结果显示,在乳腺癌中CXCR4 mRNA表达水平（1.22±0.80）高于正常乳腺组织（0.65±0.59,P=0.001）。CXCR4 mRNA在乳腺癌中表达上调与淋巴结转移数目（＞3个腋窝淋巴结转移）、Her-2表达情况（3+）密切相关（P值分别为0.013、0.031）。2.实时定量RT-PCR结果显示,在乳腺癌中CXCL12 mRNA表达水平（1.41±1.18）低于正常乳腺组织（2.02±0.71,P=0.031）。CXCL12 mRNA在乳腺癌中表达下调与淋巴结转移数目（＞3个腋窝淋巴结转移）、ER表达情况（0,1+,2+）密切相关（P值分别为0.017、0.047）。但CXCL12 mRNA在不同年龄、绝经情况、组织学分级、病理类型、肿瘤大小以及其他免疫组化指标（PR、Her-2、p53和Ki-67）组间的差异均无统计学意义（P＞0.05）。3.乳腺癌CXCR4蛋白阳性表达率为79.4%。所有20例正常乳腺组织CXCR4蛋白均阴性表达。CXCR4蛋白高表达与淋巴结转移数目（＞3个腋窝淋巴结转移）密切相关（P=0.035）。乳腺癌CXCL12蛋白阳性表达率为38.1%。所有20例正常乳腺组织CXCL12蛋白均阳性表达。乳腺癌CXCL12蛋白表达在不同患者年龄、绝经情况、淋巴结转移数目、组织学分级、病理类型、肿瘤大小以及不同免疫组化指标（ER、PR、Her-2、p53和Ki-67）组间的差异均无统计学意义（P＞0.05）。4.CXCL12基因在乳腺癌中的DNA甲基化率为52.4%。所有20例正常乳腺组织中均未检测到CXCL12基因甲基化的发生。在33例发生甲基化的乳腺癌中,20例为不完全甲基化,13例为完全甲基化。乳腺癌CXCL12基因甲基化状态与淋巴结转移数目（＞3个腋窝淋巴结转移）、ER表达情况（0,1+,2+）密切相关（P值分别为0.032、0.011）。乳腺癌CXCL12基因甲基化状态与CXCL12 mRNA表达呈负相关(r=-0.568,P=1.2×10-6),与CXCL12蛋白表达水平亦呈负相关（P=0.001）。5.实时定量PCR结果显示,在乳腺癌中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA表达相互之间呈正相关,DNMT1和DNMT3A（r=+0.272,P=0.031）、DNMT1和DNMT3B（r=+0.303,P=0.016）、DNMT3A和DNMT3B（r=+0.389,P=0.002）。DNMT1、DNMT3B基因在CXCL12发生甲基化乳腺癌的mRNA表达高于CXCL12未发生甲基化乳腺癌（P值分别为0.012、0.026）。但DNMT3A mRNA表达在CXCL12发生甲基化组和CXCL12未发生甲基化组间的差异无统计学意义（P=0.185）。研究结论1.在部分星形细胞瘤中（主要是低度恶性星形细胞瘤）,CXCL12基因通过DNMTs参与的DNA甲基化导致其表达下调。CXCR4受体在星形细胞瘤中过表达与星形细胞瘤恶性程度呈正相关。2.趋化因子CXCL12及其受体CXCR4在Ⅳ级星形细胞瘤（胶质母细胞瘤）中高表达,可能通过自分泌作用参与胶质母细胞瘤的局部侵袭。3.乳腺癌细胞通过DNMTs参与的DNA甲基化导致CXCL12表达下调,但保持CXCR4受体的高表达,与淋巴结转移情况密切相关。4.星形细胞瘤和乳腺癌DNA甲基化是导致CXCL12表达失活的主要原因之一,但并不是唯一的原因,可能还存在着其它机制。