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背景与目的:非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是以肝细胞脂质沉积为特征的代谢应激性肝脏疾病,目前已成为危害国人的主要慢性肝病类型。近期发现,NAFLD患者的体内胆汁酸池扩大,血清和肝内胆酸(cholic acid,CA)及其肠道菌群代谢产物脱氧胆酸(deoxycholic acid,DCA)水平异常,且两种胆汁酸可能与NAFLD的发生发展密切相关。然而,胆汁酸影响NAFLD的确切机制迄今仍然不甚明确。为此,本研究拟用CA、DCA刺激正常或游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)诱导的脂肪变性肝细胞,以探究CA及其代谢产物DCA对肝细胞功能的影响与作用机制。方法:将HepG2细胞随机分为CA组、FFA+CA组、DCA组和FFA+DCA组。在FFA+CA组和FFA+DCA组中,采用含油酸(oleic acid,OA)、棕榈酸(palmic acid,PA)(OA:PA=2:1)的500 M FFA刺激HepG2细胞12h,从而诱导细胞脂肪变性;在此基础上各组分别给予不同浓度的CA或DCA(0M,250M,500 M)干预12h。CA组、DCA组先用常规培养基培养12h后,再以不同浓度的CA或DCA(0M,250M,500 M)处理12h。此后采用油红O染色、甘油三酯(triglyceride,TG)测定试剂盒检测细胞脂肪变性程度;采用JC-1法检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)等线粒体去极化指标;采用DCFH-DA探针法、TBA比色法、NBT法分别检测活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性等氧化应激指标;采用CCA-8法检测细胞增殖活力;采用定量即时聚合酶链锁反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、蛋白质免疫印迹(western blot,WB)检测Nrf2、HO-1、NQO1在mRNA和蛋白水平的变化。结果:在FFA+CA组和FFA+DCA组,可观察到细胞内有大量脂滴形成,油红O染色均呈阳性;胞内TG含量显著升高(p<0.001~p<0.05)。CA组、DCA组细胞内未见明显脂滴沉积和TG水平升高。采用DCA干预后,DCA组和FFA+DCA组细胞的MMP水平呈浓度依赖性下降,同时伴有ROS、MDA水平的渐进增高和细胞增殖活力显著抑制。与对应浓度的DCA组相比,FFA+DCA组的MMP水平明显降低(p<0.01~p<0.05),氧化应激指标显著恶化(p<0.001~p<0.01),细胞增殖活力明显下降(p<0.01~p<0.05)。CA组中,经250 M CA、500 M CA处理后,细胞增殖活力显著增强(p<0.001~p<0.05);FFA+CA组中,500 M FFA+CA组的细胞增殖活力较0 M FFA+CA组显著下降(p<0.05)。采用500 M CA干预CA组和FFA+CA组,也可引起肝细胞氧化应激,但其程度在两组间未见显著差异。经DCA处理后,DCA组和FFA+DCA组中抗氧化相关基因Nrf2、HO-1、NQO1的表达在mRNA水平均有明显升高(p<0.0001~p<0.05),但在蛋白水平无明显变化。结论:DCA通过诱导线粒体去极化,可增强氧化应激及其相关的肝细胞损伤。脂肪变性能够提高肝细胞对DCA损伤的敏感性。与DCA相比,CA对肝细胞损伤作用较弱。创新点本研究探究了初级胆汁酸CA及其肠道菌群代谢产物DCA在脂肪变肝细胞中的作用及机制,旨在揭示NAFLD相关的肝细胞损伤机制。研究发现,DCA在线粒体去极化、氧化应激、细胞增殖活力等方面对肝细胞的损伤作用较CA显著,且脂变可提高肝细胞对DCA损伤的敏感性,DCA可能在NAFLD发生发展中发挥重要作用,从而可望为临床诊断和治疗提供潜在的新靶点。应用价值肝细胞在脂肪变性条件下对DCA损伤的敏感性增高,提示DCA在NAFLD发生、发展中可能发挥重要作用,这为以肠道菌群代谢产物为靶点进行NAFLD干预提供了理论基础。