研究背景：特发性炎性肌病(idiopathic inflammatory myopathy, ⅡM)是临床上常见的获得性免疫介导性肌肉疾病,发病率为1-10/百万,临床病理表现异质性较高,其主要临床表现为急性或亚急性起病的肢体近端肌无力、肌痛,后期局部肌肉有萎缩,常常累及肺脏、心脏等器官,肌肉病理显示肌纤维变性、坏死,肌内膜、肌束膜及血管周围大量炎细胞浸润。特发性炎性肌病病因仍不明确,目前研究认为有易感基因的人群在相关环境因素的作用下容易患此病。发病机制方面,炎性细胞浸润、自身抗体的产生以及肌纤维表面主要组织相容性复合体I和Ⅱ (MHC-1,Ⅱ)的过表达等支持自身免疫功能的异常与其发病相关。目前,特发性炎性肌病的治疗以免疫抑制治疗为主,主要是糖皮质激素并配合免疫抑制剂如甲氨蝶呤、环磷酰胺、硫唑嘌呤等,也可应用免疫球蛋白治疗,非特异性的免疫抑制治疗可改善一部分患者的症状,但仍有相当一部分患者对上述治疗无明显反应,且治疗有效患者在减药或停药过程中出现病情反复,加之上述药物在治疗过程中有一定的毒副作用,因此,特发性炎性肌病的发病机制仍待进一步研究,以寻找有针对性的靶向治疗方法。NLRP3炎性小体主要由单核/巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞产生,是由NLRP3、CARD结构域的凋亡相关颗粒样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1 (cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)组成的一种大分子蛋白复合体。NLRP3 (NOD-like receptor protein 3)是NLRs (Nucleotide-binding oligomerization domain like receptors, NOD-like receptor, NLRs)家族的一员,也是一种胞内模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)。接收上游信号激活后,NLRP3与ASC相结合,募集前体Pro-caspase-1,并寡聚化成多聚体,进而诱导Pro-caspase-1进行自我剪切后生成活化的Caspase-1 (p10/p20复合物)。活化的Caspase-1具有将前体pro-IL-1β和pro-IL-18,剪切成具有活性的IL-1 β和IL-18,后两者释放到细胞外,从而激活下游的炎症反应。NLRP3炎性小体已成为近年来的免疫调控的研究热点,其过度激活与多种免疫性疾病的发病密切相关,如痛风、阿尔茨海默病、多发硬化、动脉粥样硬化等。目前NLRP3炎性小体在特发性炎性肌病发病机制中的作用研究尚未见报道。研究目的：(1)观察多发性肌炎及皮肌炎患者血液和肌肉中NLRP3炎性小体及其下游因子的表达；(2)通过免疫干预特发性炎性肌病动物模型,观察NLRP3炎性小体及其下游因子的表达,以了解其治疗作用。材料与方法：(1)本研究纳入多发性肌炎10例、皮肌炎12例和对照者24例,采集三组病例血液和肌肉标本；采用ELISA方法测定其血清IL-1 β和IL-18含量；同时采用qRT-PCR技术观察其肌肉组织的IL-1β、IL-18和NLRP3的mRNA表达,采用Western blotting技术检测其肌肉组织NLF P3和Caspase-1 p20的蛋白表达；同时收集患者的人口学资料、病史、体征、血清CK、LDH值、肌电图(EMG)检查结果等；(2)为了建立实验性自身免疫性肌炎小鼠模型(EAM),本研究选用10只BALB/c小鼠分为EMA组(n=5)和对照组(n=5)；EAM组给予豚鼠骨骼肌匀浆与CFA的混合物皮下注射6周,；对照组给予等量生理盐水与CFA的混合物皮下注射6周。造模完成后,观察动物的临床表现并评分,同时采用大小鼠抓力测定仪检测造模后小鼠肢体的拉力,所得数据除以小鼠体重标准化后即为小鼠的肌力[肌力=拉力(g)/体重(g)]；采集动物模型的血液和肌肉标本,采用全自动生化分析仪检测血清肌酶含量,肌肉标本经冰冻切片,采用HE染色,观察肌肉组织形态学并留取照片,以判断EAM模型是否建立成功；(3) BALB/c小鼠10只建模,分为EAM组(n=5)和对照组(n=5),建模成功后采集其血液和肌肉标本。采用上述同样的方法检测动物血清IL-1β和IL-18浓度,肌肉组织IL-1β、IL-18、Caspase-1与NLRP3的mRNA表达和Pro-caspase-1、Caspas-1 p20与NLRP3的蛋白表达：(4)BALB/c小鼠15只建模,分为EAM治疗组(n=5).EAM组(n=5)和对照组(n=5)；建模成功后,EAM治疗组小鼠给予糖皮质激素溶液(0.2mg/ml)灌胃治疗,10mg/kg/次,每天一次,连续给药7天,其余两组小鼠给予等量生理盐水灌胃治疗。治疗结束后2周,观察动物的临床表现,同时采用上述同样的方法检测小鼠肢体肌力,血清肌酶含量,肌肉组织形态学,血清IL-1p和IL-18浓度,肌肉组织IL-1β、IL-18. Caspase-1与NLRP3的mRNA表达和Pro-caspase-1、Caspase-1 p20与NLRP3的蛋白表达；(5)数据以X±SD(均数±标准差)表示,采用SPSS17.0软件进行统计学分析,GraphPad Prism 6.0作图。对数据进行正态性和方差齐性检验,服从正态性和方差齐性的连续变量比较采用单因素方差分析或t检验,不服从正态性和方差齐性的连续变量比较采用Kruskal Wallis H检验或Wilcoxon秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。研究结果：(1) 多发性肌炎、皮肌炎患者和对照组血清IL-1p浓度分别为26.49-±=7.79 ng/ml、 25.02±8.29 ng/ml和16.49±3.30 ng/ml,与对照组比较,多发性肌炎和皮肌炎患者血清IL-1p含量显著升高(P<0.01),但多发性肌炎与皮肌炎患者之间比较,无显著差别(P=0.67)：多发性肌炎、皮肌炎和对照组患者血清IL-18浓度分别为184.8±161.7ng/ml、 214.74±198.11ng/ml和50.90±37.62ng/ml,与对照组比较,多发性肌炎和皮肌炎患者血清IL-18浓度显著升高(P<0.01),但多发性肌炎与皮肌炎患者之间比较,无显著差别(P=0.54)；与内参基因GAPDH比较计算后,得到IL-1β、IL-18和NLRP3的mRNA表达,与对照组比较,多发性肌炎和皮肌炎患者肌肉组织IL-1β、IL-18和NLRP3的mRNA表达均显著升高(P<0.01)；通过比较待测蛋白与GAPDH条带灰度,western blotting结果显示,多发性肌炎和皮肌炎患者肌肉组织NLRP3炎性小体和Caspase-1 p20蛋白表达显著高于照组(P<0.01)；(2) EAM组小鼠临床评分为2.3±0.2,对照组为0,提示EAM组小鼠临床症状重于对照组小鼠。肌肉病理EAM组小鼠呈典型肌炎改变,即出现较多的肌纤维坏变和炎细胞浸润,而对照组动物呈正常形态。EAM组CK含量(3246±478.7 IU/L)较对照组(507.6±138.2 IU/L)显著升高(P<0.01)。EAM组小鼠四肢肌力为7.1±0.9g/g,对照组为7.1±0.9g/g,有显著差别(P=0.0075)：EAM组小鼠前肢肌力为3.8±0.4g/g,对照组为5.2±0.3g/g,也有显著差别(P=0.016)；结果显示,与对照组相比,EAM组小鼠的四肢和前肢肌力均显著降低；(3) EAM组和对照组的小鼠血清中IL-1p浓度分别为36.77±3.54 ng/ml和6.26±0.77 ng/m1,与对照组相比,EAM组小鼠血清IL-1β含量极显著升高(P<0.001)：EAM组和对照组小鼠血清中IL-18浓度分别为74.28±336 ng/ml和22.02±1.07 ng/ml,与对照组相比,EAM组小鼠血清IL-1β含量板显著升高(P<0.001); qRT-PCR结果显示,EAM组肌肉组织IL-1β、IL-18、Caspase-1和NLRP3的mRNA表达均显著高于对照组(P<0.01)；通过比较待测蛋白与GAPDH条带灰度,western blotting结果显示,EAM组小鼠肌肉组织中NLRP3、Pro-caspase-1和Caspase-1 p20蛋白表达均显著高于对照组(P<0.01)；(4) EAM治疗组小鼠与EAM组小鼠的临床评分无显著差别(1.9±0.1,2.1±0.1,P=0.2),EAM治疗组小鼠四肢和前肢肌力分别为7.6±0.7g/g和4.0±0.1g/g,EAM组则分别为7.4±0.4g/g和3.7±0.2g/g,两组小鼠肌力没有显著差别(P>0.05)：但EAM治疗组小鼠CK值较对照组显著降低(1148±237.6IU/L vs.4146±566.1 IU/L,P=0.0012),肌肉病理观察显示EAM治疗组小鼠肌肉组织坏变及炎细胞浸润不明显；EAM治疗组和EAM组小鼠血清IL-1β浓度分别为24.24±3.33ng/m1和38.08土3.31 ng/ml,两组含量有显著性差异(P=0.0185)；EAM治疗组和EAM组小鼠血清IL-18浓度分别为44.34±7.52ng/ml和93.2±10.39 ng/ml,两组含量有显著性差异(P=0.0052)；qRT-PC R结果显示,EAM治疗组肌肉组织IL-1β、IL-18和NLRP3的mRNA表达均显著降低于EAM组(P<0.05)；通过比较待测蛋白与GAPDH条带灰度,estern blotting结果显示,EAM治疗组小鼠肌肉组织中NLRP3, Pro-caspase-1和Caspase-1 p20蛋白表达均显著高于对照组(P<0.01)。研究结论：(1)多发性肌炎和皮肌炎患者肌肉组织和血液NLRP3炎性小体及其下游因子明显上调,表明其在发病机制中可能起重要作用；(2)通过免疫干预特发性炎性肌病动物模型,降低了NLRP3炎性小体及其下游因子的表达,NLRP3炎性小体参与其发病,可能为新的治疗靶点。