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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是规模化猪场引发的主要疫病之一,病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)。该病毒属于尼多病毒目(Nidovirales),动脉炎病毒科(Arterivirus)成员。PRRSV基因组全长约为15kb,包含9个开放阅读框(ORFs),分别编码RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)和7个结构蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白。其中,N蛋白抗原性最强,PRRSV感染后机体首先产生的是针对N蛋白的抗体,并且在体内持续时间最长,因而该蛋白已被作为检测PRRSV血清抗体的诊断抗原。本研究通过原核表达质粒表达的蛋白和纯化的PRRSV SY00608毒株病毒免疫小鼠,成功制备了抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体,主要内容包括：1. PRRSV SY0608 N基因在大肠杆菌中的表达：以含有PRRSV N基因的pMD18T-SY11155-14254重组质粒为模板,参照已发表的PRRSV基因组序列,设计一对PCR引物,并在其上下游分别添加BamHⅠ和HindⅢ酶切位点。获得的PCR产物用BamHⅠ和HindⅢ酶切后与经同样处理的pRSET-A原核表达载体质粒连接,转化DH5α细胞后挑取阳性克隆。经酶切鉴定和测序验证后,转化至E.coli BL21中,用0.6mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)于37℃诱导表达4h后,取细菌菌体用SDS-PAGE分析。结果表明,N-SY在大肠杆菌中得到表达,重组蛋白大小约为17kDa。将表达的6×HIS-N-SY蛋白用亲和层析法进行纯化,用猪抗PRRSV血清抗体进行Western blot鉴定,结果表明,融合表达的N-SY蛋白能被PRRSV阳性血清特异性识别。2. PRRSV N蛋白单克隆抗体的制备：取纯化的PRRSV SY0608毒株重组N蛋白(HIS-N-SY)和纯化的PRRSV SY0608病毒按每只50-100μg的剂量与等量弗氏完全佐剂进行乳化,分别皮下多点注射免疫6-8周龄BALB／c小鼠。每间隔2w再用弗氏不完全佐剂乳化的重组蛋白加强免疫2次,并于融合前3d进行腹腔注射加强免疫1次。取脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞进行融合,其中,用纯化HIS-N-SY蛋白免疫的小鼠的脾细胞与SP2／0细胞的融合率为80%,首次筛选阳性率达60%,经过3次亚克隆,获得1株能稳定分泌抗N蛋白抗体的杂交瘤细胞株2H7；用纯化PRRSV SY0608全病毒免疫的小鼠的脾细胞与SP2／0细胞的融合率为90%,首次筛选阳性率为40%,经过3次亚克隆,获得2株能稳定分泌抗N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,将其命名为4A11和1G9。单抗2H7亚型鉴定结果为IgGl型,其轻链为κ链。间接免疫荧光试验证明,2H7、4A11和1G9均能与PRRSV S1和SY0608毒株产生特异性反应。Western blot试验结果表明这3株单抗能够特异性地与PRRSV N蛋白结合。采用间接ELISA法测得3株杂交瘤细胞的培养上清效价分别为1：1280、1：320和1：640,2H7的腹水效价为1：128000。将杂交瘤细胞株连续培养60d,传代20次,分别取第5、10和20代的培养上清,检测其ELISA抗体效价,结果基本一致,从而,为PRRSV诊断和N蛋白的功能研究奠定了一定基础。