背景:宫颈癌作为一种严重威胁女性健康的疾病,由于其具有易复发、易转移的特点,使得宫颈癌的化学药物疗法日益受到关注。治疗中使用到的化疗药物以铂类为主,虽然化疗效果值得肯定,但毒副作用明显,易发生肿瘤转移、耐药等困扰,临床极为期待新的有效的化疗组合方案。已有研究证明,m TOR抑制剂雷帕霉素及其类似物依维莫司和替西罗莫司都可以和顺铂联合使用,是治疗肿瘤的潜在组合药物。m TOR抑制剂主要以m TOR蛋白为靶点有效地抑制肿瘤细胞的增殖生长,促进肿瘤细胞的凋亡,逆转肿瘤细胞对化疗药物顺铂的耐药性。尽管越来越多的证据表明m TOR抑制剂与顺铂这种联合治疗在抗肿瘤领域应用的巨大潜力,但是替西罗莫司与顺铂的联合使用对宫颈癌的研究并无报道,且对其详细的作用机制尚不清楚。目的:本课题在细胞水平,考察替西罗莫司与顺铂对宫颈癌Hela细胞的有效性,筛选出最佳的药物联用组合方案,同时探索替西罗莫司与顺铂联合作用的机制。方法:1.采用MTT比色法考察替西罗莫司与顺铂单独或联合作用于对宫颈癌Hela细胞24h、48h、72h的抗增殖活性,计算半数抑制浓度IC50,筛选出最优的组合方案;2.采用流式细胞术考察替西罗莫司与顺铂联合作用对宫颈癌Hela细胞的诱导凋亡作用及周期阻滞作用,探讨联用组合方案的有效性;3.采用Transwell小室模型考察替西罗莫司与顺铂联合作用对宫颈癌Hela细胞的抗侵袭能力,考察联用组合方案对肿瘤微环境的影响。4.采用Western Blot法考察替西罗莫司与顺铂单独或联合应用对宫颈癌Hela细胞中m TOR信号通路相关蛋白m TOR、70s6k、4EBP1,周期相关蛋白cyclin D1及凋亡相关蛋白cleaved-PARP、bcl-2的表达水平的影响。结果:1.MTT结果表明替西罗莫司与顺铂联合作用于宫颈癌Hela细胞显示出优于单独给药处理的抗增殖活性。经过对半数抑制浓度IC50的计算,结果显示在加入替西罗莫司时,Hela细胞对顺铂的敏感度增强,联用组合IC50值为0.726±0.550,相较于顺铂单药(1.115±0.239)有所降低。此外,通过对联合指数CI的计算可知联用组合方案主要表现出协同效应(CI<1)。2.流式细胞术检测替西罗莫司与顺铂联合对宫颈癌Hela细胞的促凋亡作用结果显示,替西罗莫司与低浓度的顺铂联合作用时,其凋亡率提升至34.617±3.201%,显著高于两种药物单独处理的凋亡率3.流式细胞术检测替西罗莫司与顺铂联合的周期阻滞作用结果显示,联合用药组导致了细胞周期的重新分布,明显抑制了G2/M期细胞的转化,引发S期检查点失调,导致S期细胞的聚集积累。0.75μg/m L顺铂单独处理48h后的Hela细胞表现出均匀分布在G2期(45.01±4.1%)和S期(42.87%±6.78%),在加入0.05μmol/L和0.1μmol/L替西罗莫司后,G2期细胞百分比为30.21±3.56%、34.94±5.04%,S期细胞百分比为61.62±6.60%、56.42±4.89%。4.Transwell小室模型考察联合用药组对宫颈癌Hela细胞侵袭能力的结果显示,联合用药可以有效抑制细胞的侵袭能力。这一结果说明二者的联合作用在肿瘤微环境中起到了一定的抗血管生成作用。5.Western Blot法检测m TOR信号转导途径关键蛋白的表达结果表明,联合用药组主要是通过对m TOR信号转导途径的介导,抑制其下游蛋白70s6k、4EBP1的磷酸化,阻断肿瘤细胞的生存通路来协同顺铂发挥细胞毒性。同时,替西罗莫司与顺铂联合作用可以有效地降解DNA修复酶PARP,抑制负调控凋亡蛋白bcl-2的表达并抑制细胞周期蛋白家族cyclin D1蛋白的表达从而调控细胞周期分布。结论:实验结果表明替西罗莫司可以协同顺铂增强其抗宫颈癌细胞的活性,主要是通过PI3K/AKT/m TOR信号转导途径发挥二者协同效应。另一方面,替西罗莫司通过抑制细胞周期蛋白家族的cyclin D1蛋白的表达,阻止其与细胞周期蛋白依赖激酶相结合,调节酶活性协调周期进程,诱发细胞进一步分裂的DNA、蛋白质、促成熟因子无法顺利合成,将更多的细胞阻滞在DNA合成期,从而更有效地诱发肿瘤细胞的凋亡。这些结果为替西罗莫司与顺铂的联合用药提供了基础。