研究背景和目的:全球范围内,卵巢癌仍是最致命的妇科恶性肿瘤,在所有女性癌症中,其发病人数占2.5%,癌症相关死亡人数占5%。2021年在美国卵巢癌预计新发病例为21410人,死亡病例为13770人。由于缺乏有效的筛查方法,大多数卵巢癌患者在就诊时已是晚期（FIGO 2014Ⅲ-Ⅳ）,其5年生存率不足30%。卵巢癌经典一线治疗方法包括以无病灶残留（R0）为目标的减瘤手术及铂类药物为基础的联合化疗。虽然大部分患者可以获得完全缓解,但其中位无进展生存期（Progression-Free Survival,PFS）仅18个月,且超过80%的铂敏感患者将最终发展为铂耐药性复发。目前维持治疗已成为延长PFS的重要策略,包括抗血管生成药物,例如贝伐珠单抗或靶向DNA损伤修复通路的药物,如PARPi（聚ADP核糖聚合酶抑制剂）。与基于铂类药物的化疗类似,许多患者最终对PARP抑制剂产生抗药性,铂类药物和PARP抑制剂耐药的卵巢癌患者的预后极差。因此,迫切需要寻找卵巢癌新的生物标记物和治疗策略以改善卵巢癌患者预后。基因组不稳定是由于细胞内DNA损伤反应（DDR）缺陷和/或复制压力增加而引起的,这使其成为癌症的关键标志之一。这些改变通过驱动因子畸变的积累促进癌细胞的克隆进化,包括基因拷贝数的改变、重排和突变;同时,这些缺陷也使癌细胞产生了相对特异的弱点,成为恶性肿瘤治疗的靶点,从而改善患者的预后,如BRCA突变癌细胞对PARP抑制剂非常敏感,这一发现开创了生物标记物驱动的癌症“合成致死”治疗策略研究的新纪元,随后PARP抑制剂奥拉帕利、尼拉帕利等相继被批准应用于临床。目前,以DDR通路相关基因为靶点的抗肿瘤药物的治疗领域已迅速扩展到其他DNA修复和复制关键基因的抑制剂,如ATR、ATM、CHK1和CHK2、DNA-PK和WEE1。优化这些治疗方案的研究正在一系列癌症中进行,其中包括寻找靶向药物治疗反应的预测性生物标记物（BRCA突变以外）、探索内在和获得性耐药的机制以及寻找合理的治疗方案,与标准治疗（如化疗和放疗）、新型分子靶向药物和免疫检查点抑制剂的协同作用等。ATR作为DDR通路的关键基因,主要参与DNA损伤修复和细胞周期调控。研究显示ATR表达与乳腺癌分期、肿瘤恶性程度及临床预后显著相关。此外,ATR的激活部分依赖于其Ser428位点的磷酸化,磷酸化ATR（p-ATR）在食管癌的高表达与较差的预后相关。抑制ATR可显著增强子宫内膜癌、宫颈癌和卵巢癌细胞系对铂类药物的反应。此外研究发现ATR抑制优先靶向存在同源重组缺陷的肿瘤细胞,且TP53的功能缺失会增加合并有ATR缺失的成年小鼠的致死率。值得注意的是,二代测序发现96%的卵巢癌样本中存在TP53基因突变,这些前期结果使ATR成为继PARP之后另一个靶向DNA损伤修复通路的潜在治疗靶点,目前多种ATR高选择性小分子抑制剂,如AZD6738、BAY1895344和VE-822（VX-970、M6620）,已经进入多种实体瘤和白血病的Ⅰ/Ⅱ期临床试验阶段。然而,ATR在卵巢癌组织中的表达与临床预后的关系、其对卵巢癌细胞生物学功能影响及其作为卵巢癌靶向治疗靶点的潜在价值尚不清楚。本课题将从以下三个部分进行研究:第一部分:ATR、p-ATR在卵巢癌组织中的表达及其预测卵巢癌恶性特征和预后的价值研究;第二部分:靶向抑制ATR对卵巢癌细胞株生物学功能影响及其内在机制初步研究;第三部分:靶向ATR在卵巢癌治疗中协同作用靶点筛选及机制研究。第一部分:ATR、p-ATR在卵巢癌组织中的表达及其预测卵巢癌恶性特征和预后的价值研究目的:分析GTEx、TCGA数据库中正常卵巢组织和癌组织ATR mRNA表达水平,通过免疫组化检测ATR、p-ATR蛋白在卵巢癌患者原发肿瘤组织和其相应的转移及复发组织中的表达水平,结合患者临床信息资料,分析二者表达水平与卵巢癌患者临床病理特征及预后的关系。方法:1.应用网页工具GEPIA分析对比GTEx、TCGA数据库中正常卵巢组织和癌组织中ATR mRNA表达水平及其与预后的关系;2.免疫组化染色检测卵巢癌组织芯片中ATR、p-ATR的表达水平;3.应用配对t检验比较ATR、p-ATR在匹配的卵巢癌原发、转移和复发组织中的表达;4.应用Kaplan-Meier生存曲线分析ATR、p-ATR的表达水平与卵巢癌患者无病生存期及总体生存期之间的相关性,应用Cox回归模型确定二者表达水平作为总体生存期独立预测因子的价值;5.分析26例患者的临床及随访资料,应用Fisher’s Exact Test检验分析p-ATR的表达与卵巢癌患者临床病理特征之间的相关性;6.采用蛋白免疫印迹法检测多种卵巢癌细胞系内ATR通路相关蛋白的表达水平;7.采用GraphPad Prism v.8.0软件和SPSS 24.0软件进行统计学分析。结果:1.ATR mRNA在正常卵巢组织中表达水平高于卵巢癌组织,但其表达水平与卵巢癌患者无进展生存期及总体生存期无关。2.免疫组化结果显示ATR蛋白位于细胞质和细胞核内,根据染色强度进行评分:0,无染色;1+,弱染色;2+,中等染色;和3+,强染色。而p-ATR主要存在于细胞核中,根据核染色阳性的癌细胞的百分比进行评分:0,无核染色;1+,＜10%的细胞核染色阳性;2+,10%至25%的核阳性细胞;3+,26%至50%核阳性细胞;4+,51%至75%核阳性细胞;5+,＞75%核阳性细胞。ATR高表达定义为评分3+,低表达定义为评分≤2+;p-ATR高表达定义为评分＞3+,低表达定义为≤3+。3.与卵巢癌原发肿瘤组织相比,ATR（P=0.007）和p-ATR（P=0.001）表达水平在相应的复发性卵巢内癌肿瘤组织中更高,而在转移性肿瘤组织中则无明显差异（ATRP=0.326,p-ATRP=0.972）。4.Kaplan-Meier生存分析结果显示,ATR表达高低与卵巢癌患者无病生存期和总体生存期无统计学差异,而与p-ATR低表达组相比,高表达组患者的无病生存期（P=0.008）和总体生存期（P=0.0002）明显缩短。5.p-ATR表达与肿瘤的分期,分化程度,组织学亚型或手术时腹水量之间无显着差异。6.Cox回归模型分析结果显示,单因素和多因素分析均显示高水平的p-ATR对较短的总体生存期是一个显著的危险因子,风险比分别为6.96和11.393。7.ATR通路相关蛋白ATR,p-ATR,Chk1,p-Chk1在卵巢癌细胞系A2780、OVCAR5、IGROV-1、SKOV3、OVCAR8 和 CAOV-3 中均表达,表明 ATR通路在卵巢癌细胞系中处于内源性激活状态。小结:1.复发性的卵巢癌组织中ATR,p-ATR的表达水平明显高于相匹配的原发性肿瘤组织。2.p-ATR表达水平可作为卵巢癌患者预后的独立预测因子。第二部分:靶向抑制ATR对卵巢癌细胞株生物学功能影响及其内在机制初步研究目的:基于TCGA数据库分析卵巢癌相关原癌基因及DNA损伤反应通路相关基因在卵巢癌组织中表达水平,通过差异表达分析找出与ATR表达相关的基因组进行功能富集分析,从RNA水平干扰ATR表达和蛋白水平抑制ATR,p-ATR功能,观察对卵巢癌细胞增殖、凋亡、DNA损伤、克隆形成及癌细胞球体生长的影响,初步研究ATR参与卵巢癌细胞生物学行为的分子机制。方法:1.应用cBioPortal网页工具分析卵巢癌相关原癌基因及DNA损伤反应通路相关基因在卵巢癌组织中的表达水平及卵巢癌组织中与ATR呈相关性的基因组;2.应用DAVID网页工具对ATR高表达和正常表达组差异表达基因进行功能富集分析;3.通过MTT实验检测ATR特异性siRNA或高选择性抑制剂VE-822干扰ATR表达或抑制其功能后对卵巢癌细胞增殖能力的影响;4.Western blot检测ATR siRNA或抑制剂VE-822处理对卵巢癌细胞DNA损伤通路、细胞周期检测点、凋亡等相关蛋白的影响;5.通过克隆形成实验检测ATR抑制剂VE-822对卵巢癌细胞克隆形成能力的影响;6.采用Three-dimensional（3D）细胞培养实验模拟体内环境检测ATR抑制剂VE-822对卵巢癌细胞瘤体生长的抑制作用;7.采用GraphPad Prism v.8.0软件和SPSS 24.0软件进行统计学分析,所有实验均重复3次,数据用均数±标准差表示,采用one-way ANOVA进行多组间比较,组间两两比较采用LSD-t法,以α=0.05作为检验水准。结果:1.TCGA数据库分析发现在卵巢癌组织中,91.1%存在至少一个原癌基因高表达,96%存在TP53基因突变,21%存在ATR水平升高。2.差异表达分析取ATR mRNA高表达组表达升高的前150个基因进行功能富集分析,结果显示与细胞周期调控、DNA损伤修复、应对离子射线等功能相关。3.ATR特异性siRNA或高选择性抑制剂干扰ATR表达或抑制其功能后卵巢癌细胞增殖能力明显降低,呈浓度依赖性。4.Western blot结果显示,ATR siRNA可降低其蛋白的表达水平,而ATR抑制剂VE-822则通过抑制其磷酸化干扰其功能。ATR表达下降或磷酸化抑制后,其下游p-Chk1表达下降,细胞周期G2/M停滞关键蛋白p-Cdc25c,p-Cdc2表达下降,而分别代表细胞凋亡和DNA损伤的cleaved PARP、γH2AX蛋白表达随ATR siRNA和抑制剂浓度增加而升高。5.与对照组相比,ATR抑制剂VE-822处理卵巢癌细胞后其克隆形成能力明显受到抑制,并呈浓度依赖性。6.3D细胞培养模拟体内实验中,随时间延长,应用ATR抑制剂VE-822后卵巢癌细胞球体直径与对照组相比明显缩小,差异有统计学意义（P＜0.001）。小结:1.ATR在卵巢癌细胞DNA损伤修复中起重要作用,靶向抑制ATR可降低卵巢癌细胞的增殖、克隆形成及细胞球体生长的能力。2.干扰ATR表达或抑制其磷酸化可增加卵巢癌细胞DNA损伤积累并解除有丝分裂细胞周期停滞,从而导致细胞的凋亡。第三部分:靶向ATR在卵巢癌治疗中协同作用靶点筛选及机制研究目的:基于合成致死概念,构建小分子抑制剂文库,在抑制卵巢癌细胞中筛选与ATR抑制剂VE-822具有协同抑制作用的小分子抑制剂,并探讨其潜在的分子机制、评估协同靶点作为生物学标志物的价值。方法:1.初步筛选:将ATR抑制剂VE-822与文库中小分子抑制剂以4倍递增浓度单独、联合作用于SKOV3和OVCAR8细胞,MTT检测细胞活力,GraphPad Prism v.8.0处理,绘制剂量-反应曲线,计算IC50。初步筛选与ATR抑制剂具有协同作用的目标基因抑制剂。2.采用剂量反应矩阵实验,设置目标小分子抑制剂与VE-822浓度梯度,MTT检测细胞活力,SynergyFinder计算协同作用得分。3.应用卵巢癌组织芯片检测目标小分子抑制剂对应靶蛋白在卵巢癌组织中的表达,分析其与卵巢癌恶性特征和预后的关系,评估其作为卵巢癌生物标志物的价值。4.Western blot和免疫荧光实验检测目标抑制剂与VE-822联合应用后下游通路蛋白水平变化,初步探索其协同作用机制。5.克隆形成、侵袭实验、3D细胞培养模拟体内实验检测目标小分子抑制剂与VE-822的协同作用。6.采用GraphPad Prism v.8.0软件和SPSS 24.0软件进行统计学分析,所有实验均重复3次,数据用均数±标准差表示。采用one-way ANOVA进行多组间比较,组间两两比较采用LSD-t法,以α=0.05作为检验水准。结果:1.通过初步筛选发现Wee1、ATM、PLK1抑制剂与ATR抑制剂具有协同作用。2.剂量反应矩阵实验计算协同作用得分,证明Wee1抑制剂AZD1775与ATR抑制剂VE-822的对卵巢癌细胞具有较强的协同抑制作用。3.免疫组化分析法结果显示Wee1在良性卵巢肿瘤组织中的表达水平低于恶性肿瘤组织,且其表达水平与卵巢癌肿瘤分期和患者预后相关。4.Western blot结果显示,ATR与Wee1通路相关蛋白在卵巢癌细胞系中均表达。5.免疫荧光定位Wee1蛋白在卵巢癌细胞胞浆、胞核内均有分布,且AZD1775处理明显抑制卵巢癌细胞增殖和Wee1表达。6.免疫荧光实验显示,与对照组和ATR抑制剂VE-822及Wee1抑制剂AZD1775单独用药组相比,联合用药组明显抑制卵巢癌细胞增殖并增加卵巢癌细胞中γH2AX蛋白的表达。7.与单独用药相比,Wee1抑制剂与ATR抑制剂联合应用后p-Chk1,p-Cdc2,Survivn表达明显下降,cleaved PARP、γH2AX蛋白表达升高。8.与单独应用和对照组相比,联合应用明显抑制卵巢癌细胞克隆形成、侵袭及球体生长能力,差异具有统计学意义（P＜0.05）。小结:1.ATR抑制剂VE-822与Wee1抑制剂AZD1775在抑制卵巢癌细胞增殖、克隆形成、侵袭、细胞球体生长方面具有较强的协同作用。2.VE-822与AZD1775协同作用机制主要是通过增加卵巢癌细胞内DNA损伤积累和降低有丝分裂检查点活性从而导致有丝分裂灾难,进而诱导细胞凋亡。3.Wee1表达水平与卵巢癌恶性特征及患者预后相关,或可成为临床生物标志物。结论:1.高水平ATR,p-ATR表达与卵巢癌患者的复发密切相关,p-ATR高表达和较短的生存期密切相关,可作为卵巢癌患者预后的独立预测因子。2.卵巢癌细胞中ATR可能通过DNA损伤修复和有丝分裂临时停滞应对复制压力及DNA损伤,靶向抑制ATR可显著降低卵巢癌细胞增殖并促进细胞凋亡。3.ATR抑制剂VE-822与Wee1抑制剂AZD1775在抑制卵巢癌细胞增殖中具有明显的协同作用。4.Wee1可作为判断卵巢癌恶性特征及预后的生物标志物。