鼓槌石斛(Dendrobiun chrysotoxum Lindl),为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生附生草本植物,又名金弓石斛。其花金黄色,气味芳香,花期较长,具有良好的观赏价值。同时,其茎内含有多糖、毛兰素、毛兰菲及鼓槌菲等有效成分,具有较高的药用价值。鼓槌石斛是兼具观赏与药用于一身的珍贵石斛种类之一,开发应用前景广阔。随着对鼓槌石斛保健价值认识的提高和市场需求量的日趋增长,其野生资源遭到严重破坏,种苗数量严重不足。为了保护现有的野生资源,满足日益增长的市场需求,对鼓槌石斛进行组培快繁技术研究迫在眉睫。另外,石斛的主要药用成分之一多糖,因为其具有调节免疫、降低血糖及抗肿瘤等功能,引起了众多专家学者的广泛关注。但目前对石斛多糖的研究主要集中于对其多糖含量测定、结构分析、多糖相关酶活性测定等生理生化方面,而有关克隆鼓槌石斛多糖代谢中的相关基因以及该基因的表达研究等分子生物学方面还未见报道。因此有必要采用现代生物技术手段进行鼓槌石斛的研究。本试验以鼓槌石斛为材料,进行离体快繁、蔗糖磷酸合成酶SPS基因克隆及其qRT-PCR分析研究,为鼓槌石斛苗木生产提供技术支持;并为研究石斛多糖合成机理、代谢路径及培养优质石斛新品种奠定基础。研究结果如下:1鼓槌石斛的离体快繁研究首先,以鼓槌石斛种子为外植体,建立了无菌体系。将种子接入无菌萌发培养基1/4MS+0.5 mg·L-1KT+1.0g·L-1蛋白胨+150 g·L-1椰乳+15 g·L-1糖+1.0g·L-1AC中,(PH=6.0)。30 d后可见种子全部萌发,萌发率100%。85 d后形成绿色无菌小苗,生长状况较好,成功获得无菌增殖材料。其次,将初代培养85 d的无菌幼苗进行增殖培养,通过正交试验比较培养基种类、NAA和6-BA浓度、香蕉泥浓度对无菌苗增殖的影响,筛选出适宜的增殖培养基。试验结果表明,4种因素对鼓槌石斛增殖效果的影响大小为:香蕉泥>6-BA>NAA>基础培养基;最佳增殖培养基为:MS+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L BA+50 g/L香蕉泥,增殖系数高达4.7,且幼苗长势良好。之后以正交试验结果的最佳培养基为基础培养基,对增殖条件进行了优化处理。无菌苗增殖的优化条件:糖浓度为30 g/L,有机添加物为香蕉泥,接种苗株高在2.5 cm左右,丛植芽数量为5株/丛时有利于提高增殖系数和促进小苗的生长。最后,以株高大于3 cm的试管苗为材料进行生根研究,结果表明:选用NAA 0.3 mg·L-1壮苗生根效果最好,在木屑基质中成活率100%。2不同方法对鼓槌石斛根、茎、叶RNA的提取本研究根据石斛中富含多糖、多酚类等次生代谢产物的特点,选择Triozl试剂盒法、RNA prep Pure Plant Kit试剂盒法和CTAB法3种提取方法进行了比较。结果表明:CTAB法提取的总RNA条带较清晰,OD260/OD280在2.0左右,RNA的浓度在200~600μg/μL之间,RNA纯度较高,能够满足下一步试验需要。因此,CTAB法是较理想的提取鼓槌石斛根、茎、叶RNA的方法。3鼓槌石斛SPS基因片段的克隆本研究成功克隆了鼓槌石斛SPS基因。经过测序结果分析,其序列长度为2411 bp,编码803个氨基酸,与兰科植物铁皮石斛的SPS基因氨基酸序列的一致性最高,为97%,与其他科植物SPS基因的氨基酸序列的一致性均高于72%。系统进化分析也表明该基因与单子叶植物在进化上亲缘关系较近。生物信息学分析表明,鼓槌石斛SPS基因编码的蛋白属于亲水性蛋白,有2个功能结构域,分别是蔗糖合成功能域及糖基转移功能域。本试验首次克隆并报道了鼓槌石斛SPS基因。将该基因命名为Dendrobium chrysotoxum SPS,并在GenBank注册,登录号为:KP696500。4鼓槌石斛EF-1α基因的克隆本研究首次克隆了鼓槌石斛3个EF-1α基因片段,其序列长度均为620 bp,均编码206个氨基酸,将这些片段进行Blast比较,结果显示:3条序列与其他植物的EF-1α基因核苷酸序列的同源性均在87%-89%之间,而氨基酸序列的同源性都在99%以上,通过对EF-1α基因序列的聚类分析发现,鼓槌石斛的3个EF-1α基因无论与单子叶植物还是双子叶植物的EF-1α亲缘关系都非常近,与单子叶植物油棕、蝴蝶兰的一致性达100%,再次证明高等植物的EF-1α基因是一种高度保守的看家基因,为研究其他基因的表达奠定了基础。5鼓槌石斛SPS基因的时空表达分析本试验以成功克隆出的鼓槌石斛EF-1α基因作为内参基因,通过RT-qPCR方法,对鼓槌石斛中不同生长年限的叶片、茎部及根中SPS基因的相对表达量进行了分析。结果表明,SPS基因在鼓槌石斛的根、茎、叶中均有表达,而在不同组织之间的相对表达量因不同生长年限而有所差异。从总体来看,SPS基因在鼓槌石斛组织中的表达呈现茎>叶>根的趋势,且不管是植株的叶还是茎,SPS在第二年的生长时期的相对表达量达到最高峰,之后随着时间的推移有所下降,表明该基因可能在叶片蔗糖合成代谢过程中及对茎中蔗糖的积累起重要作用。