论文部分内容阅读
本文主要从以下几个部分展开论述： 第一部分 血清丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶参考物质互通性和检测方法性能评价研究 目的:本研究旨在考察室间质量评价(EQAS)材料，商品化校准品和质控品、冰冻混合人血清(HSPs)、牛血清白蛋白(BSA)溶液和动物血清等制备物在13种常规检测系统上的互通性，并进行常规方法的偏倚评价。 方法:根据美国临床实验室标准化委员会(CLSI)EP9-A3和EP14-A3文件，分别评价各制备物的互通性和各方法的检测偏倚。留取2017年5月至8月北京医院、朝阳医院和同仁医院患者单人血清200～300人份。将13种常规方法按是否添加磷酸吡哆醛（P-5-P）分为两组，各测定足够数量的一套单人血清样本和待评价制备物中的ALT或AST。待评价制备物包括国内EQAS材料、IFCC参考实验室EQAS(External Quality Assessment Scheme for Reference Laboratories in Laboratory Medicine，RELA-IFCC)材料、商品化校准品和质控品、定制HSPs、自制HSPs（添加人源性重组酶）、BSA溶液制备物和动物血清。互通性研究中，11种不添加P-5-P方法两两比对采用Deming回归分析单人血清检测结果，2种添加P-5-P方法分别与参考方法配对用简单线性回归分析，计算回归线的95％预测区间评估制备物互通性，并计算不互通制备物的互通性相关偏倚(CRBs)。同时采用中国卫生行业标准中ALT和AST允许偏倚评价各制备物的CRBs。偏倚评价研究中，将IFCC参考测量程序作为添加P-5-P组的比对方法，将所有不添加P-5-P常规方法的检测均值作为不添加P-5-P组的靶值;将13种常规方法作为待评价方法。计算各常规方法基于参考方法结果或靶值的相对偏倚和绝对偏倚的中位数，采用基于生物变异的性能评价标准中最佳、适宜和最低要求评价各方法的检测偏倚。 结果:13种常规方法ALT检测的决定性系数0.9954～0.9999;Deming分析的斜率0.879～1.058，截距-1.95～+3.30;简单线性回归的斜率为0.905和0.994，截距为-6.71和8.00。AST检测的决定系数0.9906～0.9999;Deming分析的斜率0.817～1.136;截距-2.80～+2.02;简单线性回归的斜率0.891和0.855，截距1.54和2.23。互通性评价结果显示，对于冻干制备物，常规化学EQAS材料在10％～84％(ALT)和10％～56％(AST)的方法对上互通;采供血机构EQAS材料在21％～69％(ALT)的组合上互通、RELA材料在0～10％(ALT)和19％～33％(AST)的方法对上互通;商品化校准品和质控品在23％～81％(ALT)和19％～44％(AST)的组合上互通。对于冰冻材料，定制HSPs在0～43％(ALT)和5％～76％(AST)的方法对上互通;动物血清在37％～40％(ALT)和75％(AST)的组合上互通;自制HSPs1、自制HSPs2、自制HSPs3以及BSA分别24％～98％(ALT)和43％～100％(AST)、19％～95％(ALT)和5％～95％(AST)、29％～81％(ALT)和14％～95％(AST)以及19％～71％(ALT)和24％～76％(AST)的方法对上互通。经行标允许偏倚重新评估后，所有制备物互通性均有进步，除个别物质外，均能在50％～80％的方法对上互通。血清ALT检测偏倚结果显示，奥森多、雅培、贝克曼、中生、九强、迈克和西门子Advia为正偏倚，西门子Dimension、科华、利德曼和罗氏为负偏倚，德赛和和光偏倚中位数接近0;13种方法中11种能满足生物学变异ALT适宜偏倚要求(11.5％)。血清AST检测偏倚结果显示，贝克曼、中生、德赛、利德曼和西门子Advia为正偏倚，奥森多、西门子Dimension、雅培、九强、科华、罗氏和和光为负偏倚，迈克偏倚中位数接近0;13种方法中10种能满足生物学变异AST最低偏倚要求(9.9％)。 结论:多数常规方法可比性较好且方法性能理想。现有室间质评材料、商品化校准品和质控品存在不同程度的互通性问题。添加人源性重组酶的混合人血清具有相对理想的互通性，可作为互通质评材料的重要来源。 第二部分 液相色谱质谱法检测丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶活性的可行性研究 目的:建立血清ALT和AST酶学反应体系中首步反应产物谷氨酸（glutamic acid，Glu）的基于液相色谱串联质谱(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)原理的检测方法，并对所建方法进行性能验证，为LC-MS/MS两点速率法检测血清转氨酶新技术的开发提供基础。 方法:将液相馏分收集和液质检测相结合测定ALT和AST体系中的Glu。基于同位素稀释质谱法的原理，选择Glu-13C5作同位素内标，采用重量法准确称量血清样本、Glu标准溶液S1-S5（标准曲线法）和同位素内标溶液的质量。利用含0.1％甲酸的甲醇和正己烷混合有机溶剂抽提样本，离心，取甲醇水层烘干，流动相重组，重组样本进行液相馏分收集，收集的馏分用LC-MS/MS进行检测。评价方法的标准曲线线性、检测限、定量限、正确度、精密度和加样回收率等。 结果:液相馏分收集采用Hypercarb色谱柱，流速为1.0mL/min，进样量20μL;流动相条件为水∶甲醇(V∶V)=98∶2（含0.05％三氟乙酸），单泵输送，收集ALT体系中Glu的最佳时间窗为3.3min-3.7min，收集AST体系中Glu的最佳时间窗为3.6min-4.0min，分析时间6min。液质检测采用SymmetryShield RP18色谱柱，流速为0.15mL/min，流动相条件为水∶甲醇(V∶V)=98∶2（含0.02％乙酸），单泵输送;在电喷雾离子源正离子多反应监测模式下检测148＞84 (m/z)和153＞88 (m/z)作为定量离子对，148＞130 (m/z)和153＞135 (m/z)作为定性离子对;ALT体系收集产物的液质分析时间为4.5 min，AST体系收集产物的液质分析时间为6 min。ALT体系标准曲线R范围0.9990～0.9998;除低浓度Sigma标准溶液外，中、高浓度标液的检测偏倚基本在5％以内;所有样本批内在3％以内，总CV几乎都在10％以内;方法回收率89.0％～111.9％。AST体系标准曲线R范围0.9530～0.9942;高浓度Sigma标准溶液的检测偏倚5％左右，低、中浓度标液的检测偏倚变异大，接近或超过50％;所有样本批内CV为0.8～16.4％，总CV为8.2～101.1％，变异大;方法回收率77.9％～183.1％。 结论:本研究建立了液相馏分收集联合液质检测酶底物溶液和血清混合基质中ALT和AST首步反应产物——谷氨酸的检测方法。其中，检测ALT体系中的谷氨酸浓度方法性能验证较满意，检测AST体系中的谷氨酸浓度尚存在问题，可能与天冬氨酸固体试剂化学纯度有关。基于LC-MS/MS原理的检测血清转氨酶活性浓度新技术中转氨酶反应部分仍有待开发。