[背景]随着国民经济的发展及人口结构老年化,脑血管病已经成为危害我国中老年人身体健康和生命的主要疾病,其中缺血性脑卒中约占脑血管病75%。脑卒中患者常存在不同程度的肢体运动功能受损、失语、认知精神障碍等,直接影响患者生活质量和康复治疗效果,给家庭和社会带来巨大的伤害和沉重的经济负担。传统观点认为神经损伤后难以再生,神经功能的缺失是永久的,不能恢复。近年来的研究证实,成年啮齿类动物脑组织的侧脑室下区及海马区存在内源性神经干细胞,在受到缺血缺氧、外伤、癫痫、生长因子等因素刺激下,可持续活化,发生增殖、迁移及分化,对受损神经网络修复和神经功能重建中发挥作用,为脑卒中等脑血管疾病的治疗提供了新的突破口。然而,许多研究揭示脑缺血后虽然可引起海马区内源性神经干细胞的神经发生,但内源性神经干细胞的数量不足,而且某些调节迁移、分化、存活、神经元修复和突触形成的因子也不足。因此,进一步研究并利用生物化学及物理因素等方法来扩大内源性神经干细胞的发生,促进其增殖,并向缺血坏死灶迁移,促进其分化成为神经细胞,对修复脑卒中后神经系统网络,提高大脑的可塑性,促进神经功能的恢复具有重要的研究意义。经颅磁刺激(Transcranial Magnetic Stimulation,TMS)是基于快速电磁转换原理,利用磁场作用于中枢神经系统,使大脑皮层及皮层下神经细胞产生感应性生物电流,影响脑内代谢过程及神经细胞电活动,从而引起一系列生理生化效应的非侵入性技术。超低频经颅磁刺激(Infra-low-frequency transcranial magnetic stimulation, ILF-TMS)是刺激频率0～0.2Hz之间的磁刺激。目前大多数对TMS的研究频率均在Hz水平,针对更低刺激频率的研究则比较少。大量的临床及动物实验证实,ILF-TMS在治疗脑损伤疾病如帕金森病、抑郁、脑血管疾病等和精神类疾病如抑郁、焦虑、失眠等取得了良好的效果。有研究证实,采用ILF-TMS治疗缺血性脑卒中,可明显改善病人包括精细动作等的运动功能、看图识物能力、命名能力及语言表达能力。ILF-TMS可通过干预神经递质的活性影响脑的功能,具有特殊的生物物理特性及临床应用价值。随着ILF-TMS应用领域的不断拓宽,其治疗机制的问题也日益受到人们的重视。目前的许多研究提示ILF-TMS治疗CNS疾病可能通过影响eNSCs而发挥作用,如ILF-TMS可促进海马齿状回BDNF,5-HT,DA等的表达。ILF-TMS可引起脑内微环境的变化,而微环境则是影响eNSCs的重要因素。ILF-TMS的连续磁场可在脑区产生超低频电流,进而模拟多种神经递质的慢突触后电位的作用。施加的ILF-TMS频率不同,可分别影响兴奋性神经递质和抑制性神经递质。我们前期的实验提示,对大脑中动脉缺血再灌注(MCAO)损伤大鼠给予11mHz ILF-TMS治疗后,通过免疫组织化学染色检测海马区内源性神经干细胞5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)及巢蛋白(nestin)的表达,发现与假刺激组比较,ILF-TMS治疗组大鼠内源性神经干细胞(endogenous Neural stem cells,eNSCs)得到持续的激活,BrdU及nestin得到更多的表达,且18分制神经功能障碍评分更高。[目的]本实验通过进一步观察ILF-TMS干预后对局部脑缺血再灌注大鼠7天、14天、21天及28天4个不同时相海马区齿状回颗粒下层(subgranular zone,SGZ)及颗粒细胞层(granule cell layer,GCL)内源性神经干细胞增殖、迁移及分化的影响,并采用mNSS神经功能障碍评分方法对各组大鼠进行神经功能评定,试图探讨ILF-TMS在缺血性脑卒中海马齿状回神经损伤修复过程中的作用机制,为ILF-TMS应用于临床脑卒中患者的治疗提供更充分的理论依据。[方法]1、参照Longa等的线栓法建立大鼠右侧大脑中动脉栓塞缺血再灌注损伤模型(MCAO)。将造模成功的大鼠随机分配到ILF-TMS7天组、ILF-TMS 14天组、ILF-TMS 21天组、ILF-TMS28天组及假刺激7天组、假刺激14天组、假刺激21天组、假刺激28天组；同时设立假手术7天组、假手术14天组、假手术21天组及假手术28天组。2、对ILF-TMS组大鼠给予刺激频率为11mHz,场强均为500 Gs的超低频经颅磁刺激,每次30 min,1次/天；假刺激组大鼠同样放置磁刺激仪内固定,但不进行超低频经颅磁刺激,余处理同ILF-TMS组大鼠；假手术组大鼠自然饲养。3、各组大鼠在处死前24小时腹腔注射Brdu,每次间隔4小时,共3次。末次注射12h后处死动物取材。4、分别在第7天、第14天、第21天及28天应用改良神经功能缺损程度评分方法(mNSS)对各组大鼠进行神经功能评定。5、将评分后的大鼠处死后取脑,置于4%多聚甲醛中后固定过夜,之后石蜡包埋,行连续冠状位切片。通过苏木精-伊红染色法(HE染色)观察缺血组织病理形态,免疫荧光染色检测缺血后7天、14天、21天与28天4个不同时相海马区齿状回颗粒下层(SGZ)及颗粒细胞层(GCL)BrdU+、PSA-NCAM+、NeuN+、GFAP+表达的变化。采用Image-Pro Plus软件进行图形分析,计算每平方毫米的阳性细胞数。[统计学方法]应用spss 19.0版统计软件,计量资料以均数士标准差表示(x±s),多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。[结果]1、各时间点假手术组大鼠活动情况较好,与ILF-TMS组大鼠及假刺激组大鼠比较,差异有统计学意义(P<0.05)。第14天、21天及28天3个时间点,ILF-TMS组较假刺激组大鼠mNSS评分降低,差异有统计学意义(P<0.05)。ILF-TMS组及假刺激组大鼠mNSS评分随时间的延长而逐渐降低,组内任意两时间点之间差异有统计学意义(P<0.05)。2、病理学观察HE染色光镜下可见假手术组大脑皮质及海马区细胞排列整齐,组织结构完整。局部缺血再灌注后,大鼠右侧大脑皮质可见缺血灶,细胞变性坏死。海马区细胞排列紊乱,部分细胞结构不清,可见核固缩,核仁消失。ILF-TMS组大鼠脑组织上述病理改变较假刺激组减轻,细胞存活数量较假手术组多,神经细胞排列基本规整。存活细胞大小及形态基本正常,核仁清晰,胞浆蓝染。3、海马齿状回BrdU+细胞数表达的变化：各组大鼠海马齿状回均有BrdU+细胞分布。在7天、14天、21天、28天4个时间点,局部缺血再灌注大鼠海马齿状回BrdU+细胞数均高于假手术组(均P<0.05)。而在局部缺血再灌注后同一时相,ILF-TMS组大鼠海马齿状回BrdU+细胞数均高于假刺激组(均P<0.05)。4、海马齿状回BrdU+/PSA-NCAM+细胞表达的变化：假手术组海马齿状回仅能观察到少量BrdU+/PSA-NCAM+细胞。同一时间点,局部缺血再灌注大鼠BrdU+/PSA-NCAM+细胞数均高于假手术组(均P<0.05)。而在局部缺血再灌注14天后,ILF-TMS组大鼠海马齿状回BrdU+/PSA-NCAM+细胞数高于假刺激组(均P<0.05)。5、海马齿状回BrdU+/NeuN+细胞表达的变化：假手术组海马齿状回仅能观察到少量BrdU+/NeuN+细胞。在第7天后,局部缺血再灌注大鼠BrdU+/NeuN+细胞数均高于假手术组(P<0.05)。在SGZ区,不同时间点ILF-TMS组BrdU+/NeuN+细胞数与假刺激组比较无显著差异(均P>0.05)。在GCL区,21天及28天ILF-TMS组BrdU+/NeuN+细胞数较假刺激组显著增多(P<0.05)。6、海马齿状回BrdU+/GFAP+细胞表达的变化：假手术组海马齿状回仅能观察到少量BrdU+/GFAP+细胞。在14天后,局部缺血再灌注大鼠BrdU+/GFAP+细胞数均高于假手术组(均P<0.05)。在SGZ区,14天后,假刺激组BrdU+/GFAP+胞数较ILF-TMS组增多(P<0.05)。在GCL区,21天及28天假刺激组BrdU+/GFAP+细胞数较ILF-TMS显著增多(P<0.05)。[结论]1、大脑中动脉缺血再灌注损伤可引起大鼠海马区内源性神经干细胞的增殖明显增多,增殖的干细胞可以发生迁移并分化成为神经元细胞及神经胶质细胞。2、大鼠脑梗死后有一定的自我恢复能力,超低频经颅磁刺激治疗组大鼠神经功能行为学评分改善更明显,其原因可能与内源性神经干细胞的发生相关。3、11mHz超低频经颅磁刺激能促进局部脑缺血再灌注大鼠海马区齿状回神经干细胞的增殖,由颗粒下层迁移至颗粒细胞层,并促进内源性神经干细胞向神经元细胞分化。