脑血管疾病是因颅内血液循环障碍而造成脑组织损害的一组疾病，临床上以急性发病居多，分为出血性和缺血性两类，其中缺血性疾病更占多数。局灶性脑缺血和全脑缺血都是围术期严重的并发症。局灶性脑卒中治疗的重点是脑缺血半暗带，而发生全脑缺血时最敏感的区域是海马。脑缺血导致的神经细胞损伤，在缺血部位恢复血液灌注后，其损伤进一步加重，称之为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury）。其发病机制复杂，涉及能量代谢障碍，细胞内钙稳态失衡，氧化应激，炎症损伤及细胞凋亡等等。这些环节相互联系，相互激发，形成快速级联反应，迅速加重损伤。　　近年来，大量研究显示异氟醚预处理对脑缺血再灌注损伤有保护作用，但是其确切机制尚不清楚。以往研究认为异氟醚预处理抑制了脑缺血再灌注过程中的炎性反应，而Toll样受体4（Toll like receptors，TLR4）属于先天性免疫细胞中的跨膜受体及病原模式识别受体，在急性炎症反应中调节细胞吞噬作用，以及在细胞信号转导和细胞凋亡中起重要作用。有研究表明TLR4参与了脑缺血再灌注损伤时神经细胞的凋亡，那么异氟醚预处理是否参与了该途径而发挥神经保护作用。本研究针对这一问题进行了进一步研究，为异氟醚预处理和脑保护研究提供新的理论和实验依据。　　第一部分异氟醚预处理对小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用　　目的：明确异氟醚预处理是否影响局灶性脑缺血损伤时缺血半暗带区域TLR4的表达。　　方法：健康雄性C57BL/6小鼠30只，随机分为3组（n=10）。假手术组（sham组）：只分离血管，不进行其余操作。局灶性脑缺血再灌注组（I/R组）：制备右侧大脑中动脉阻塞（Middle Cerebral Arterial Occlusion，MCAO）模型，60min后拔出线栓，恢复血供24h。异氟醚预处理组（ISO组）：使用1.5％异氟醚预处理2h，24h后制作MCAO模型，60min后拔出线栓，恢复血供24h。通过Western Blot法检测各组小鼠右侧脑缺血半暗带区域TLR4和LAMP2A的表达情况。　　结果：Western Blot法检测显示，与sham组比较，I/R组和ISO组受到缺血再灌注损伤，缺血半暗带TLR4蛋白和LAMP2A表达显著增高，p＜0.05；而与 I/R组比较，ISO组接受异氟醚预处理，其缺血半暗带 TLR4和 LAMP2A蛋白表达降低，有统计学意义，p＜0.05。　　结论：异氟醚预处理降低小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤时脑缺血半暗带区域TLR4和LAMP2A蛋白的表达。　　第二部分异氟醚预处理对小鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用　　目的：明确异氟醚预处理是否影响全脑缺血再灌注损伤时海马区域和皮层神经细胞TLR4和LAMP2A的表达。　　方法：健康雄性 C57BL/6小鼠30只，随机分为3组（n=10）。假手术组（sham组）：只分离血管，不进行其余操作。全脑缺血再灌注组（I/R组）：夹闭双侧颈动脉制作全脑缺血模型，10min后开放双侧颈动脉，恢复大脑血供。异氟醚预处理组（ISO组）：使用1.5%异氟醚预处理2h，24h后制作全脑缺血模型，10min后开放双侧颈动脉，恢复大脑血供。24h后，通过Western Blot法检测各组小鼠海马区TLR4和LAMP2A蛋白表达的情况。　　结果：Western Blot法检测显示，与sham组比较，I/R组和ISO组受到缺血再灌注损伤，海马区TLR4和LAMP2A蛋白表达显著增高，p＜0.05；而与I/R组比较，ISO组接受异氟醚预处理，其海马区TLR4和LAMP2A蛋白表达降低，有统计学意义，p＜0.05。　　结论：异氟醚预处理降低小鼠全脑缺血再灌注损伤时海马区TLR4和LAMP2A蛋白的表达。　　第三部分异氟醚预处理对离体神经元缺血再灌注损伤时TLR4和LAMP2A表达的影响　　目的：明确异氟醚预处理对离体神经元缺血再灌注损伤时TLR4和LAMP2A表达的影响。　　方法：原代培养的神经细胞随机分为3组。对照组（sham组），细胞不经任何处理；氧糖剥夺组（OGD组），于神经细胞接种第8天进行OGD处理2h，复氧复糖24h；异氟醚预处理组（ISO组），于神经细胞接种第7天进行异氟醚预处理，24h后进行 OGD处理2h，复氧复糖24h。通过细胞免疫荧光染色和Western Blot法检测神经元TLR4和NF-κB的表达。　　结果：细胞免疫组化染色显示 OGD/R损伤可以造成神经元 TLR4和LAMP2A表达增加，接受异氟醚预处理可以减少 OGD/R损伤后 TLR4和LAMP2A的表达。Western Blot法测定各组TLR4和LAMP2A表达，也可以得到相同结果。　　结论：异氟醚预处理降低离体神经元缺血再灌注损伤时TLR4和LAMP2A的表达。　　第四部分异氟醚预处理通过下调TLR4抑制神经细胞凋亡和自噬　　目的：研究异氟醚预处理对神经细胞缺血再灌注损伤的保护作用及机制。方法：培养至对数生长期的PC12细胞，随机分为5组：对照组（sham组），细胞不经任何处理；氧糖剥夺模型组（OGD组），进行OGD处理4h，复氧复糖24h；异氟醚预处理组（ISO pc+OGD，ISO组），进行异氟醚预处理后24h再进行OGD/R处理；TLR4抑制剂组（CLI-095+OGD，CLI-095组），进行OGD/R处理前24h给与TLR4抑制剂CLI-095；TLR4激动剂组（ISO pc+LPS+OGD， LPS组），细胞传代后加入TLR4激动剂LPS，24h后进行异氟醚预处理2h，24h后再进行OGD/R处理。　　通过 MTT法检测细胞存活数，流式细胞技术检测各组细胞凋亡率。通过Western Blot法检测各组细胞TLR4、NF-κB和LAMP2A的表达。　　结果：通过MTT检测发现与sham组相比，OGD组、ISO组、CLI-095组和LPS组OD值显著降低。而与OGD组相比，ISO组和CLI-095组OD值增高。LPS组OD值与OGD组没有显著差异。　　通过流式细胞技术检测各组细胞的凋亡率，与sham组相比，OGD组、ISO组、CLI-095组和LPS组PC12细胞凋亡率均增高，差异有统计学意义。而ISO组和CLI-095组的细胞凋亡率与OGD组相比较明显下降，LPS组凋亡率与OGD组相比较无明显差异。　　使用Western Blot法测定各组PC12细胞的TLR4、NF-κB和LAMP2A蛋白表达，与sham组比较，OGD组、ISO组、CLI-095组和LPS组TLR4和NF-κB蛋白表达显著增高；与OGD组比较，ISO组和 CLI-095组 TLR4、NF-κB和LAMP2A蛋白表达显著降低，而LPS组的蛋白表达无明显差异。　　结论：异氟醚预处理通过下调TLR4抑制神经细胞凋亡和自噬对神经细胞缺血再灌注损伤产生保护作用。　　在脑缺血再灌注损伤发生时除了炎性反应被激活，分子伴侣介导的自噬也被激活。异氟醚预处理可以抑制神经元TLR4激活，而TLR4对CMA也具有一定的调控作用。表现为异氟醚预处理可以使LAMP2A的表达减少，而给与TLR4抑制剂后，LAMP2A表达相应增加。我们推测异氟醚预处理对神经系统的保护作用部分是通过下调TLR4抑制细胞凋亡和自噬来达到的。