研究背景：刚地弓形虫是一种专性细胞内寄生的机会性致病原虫,可感染包含人类、牲畜、海洋哺乳动物等在内的大多数温血动物,导致弓形虫病的发生,严重影响公共健康。尽管在不同的国家和地区,刚地弓形虫的感染率是不同的,但弓形虫病的流行呈上升趋势。因此,研制能够预防和控制弓形虫病的有效疫苗迫在眉睫。研究目的：构建弓形虫多表位DNA疫苗及能表达细胞因子RANTES的重组载体作为疫苗佐剂,研究该多表位疫苗对感染急性弓形虫病小鼠的免疫保护作用,评价RANTES基因佐剂对多表位DNA疫苗诱导小鼠免疫应答的调节及加强作用。研究方法：首先利用生物信息学软件和网络在线预测工具预测弓形虫SAG1,GRA2, GRA7和ROP16四种抗原的T细胞表位和B细胞表位,筛选出12个优势表位,经人工合成编码多表位的基因片段MEG (Multi-epitope Gene),利用分子生物学技术与方法,构建了T-A克隆载体。经过正确的鉴定,将回收纯化的目的片段MEG亚克隆至表达载体pEGFP-C1中,构建了重组表达质粒pEGFP-TgMEG (pTgMEG)。利用RT-PCR技术扩增小鼠脾脏内活化T细胞表达与分泌调节因子RANTES基因,构建T-A克隆载体,经过正确的鉴定,将回收纯化的目的片段RANTES亚克隆至真核表达载体pEGFP-C1中,构建了重组表达质粒pEGFP-RANTES (pRANTES)。构建的两个重组表达质粒经过一系列的鉴定均正确后,将其转到HEK293T细胞中进行体外表达,荧光显微镜下观察目的蛋白的表达情况；通过SDS-PAGE和Western blotting两种实验技术检测目的蛋白的活性情况。然后大量提取两种重组质粒分别制备疫苗和佐剂,经肌肉注射免疫接种BALB/c小鼠,检测小鼠体内产生的细胞免疫与体液免疫反应；用1000个弓形虫RH株速殖子腹腔感染小鼠,进行攻击实验,观察小鼠的发病情况,记录小鼠的生存时间。最后根据实验数据来分析疫苗和佐剂的免疫保护作用。结果：成功构建了重组表达载体pTgMEG和pRANTES,经PCR、酶切和DNA测序鉴定正确,各目的基因片段完整准确地连接到表达载体pEGFP-Cl上。将pTgMEG和pRANTES瞬时转染HEK293T细胞,在荧光显微镜下均可观察到蛋白的表达,然后经SDS-PAGE和Western blotting验证均为目的蛋白。动物实验结果显示,与对照组相比,多表位DNA疫苗pTgMEG组的小鼠产生更高水平的抗弓形虫IgG、IgG2a. IFN-y和CD8+/CD4+,另外小鼠的平均存活时间也显著延长；而且基因佐剂pEGFP-RANTES的联合使用,明显提高上述检测指标。但各组间IgG1、 IL-4和IL-10水平并无显著性差异。结论：弓形虫多表位DNA疫苗能够刺激BALB/c系小鼠产生较强的体液和细胞免疫应答(主要是Thl免疫反应和CD8+T细胞免疫反应)；基因佐剂pRANTES能有效增强多表位DNA疫苗诱导的细胞和体液免疫反应。