【摘 要】
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目的:预测并验证对小鼠Foxp3(mFoxp3)有调控作用的miRNAs.通过生物信息学预测可作用于mFoxp3的6个miRNAs，构建其pre-miRNAs表达载体和mFoxp3-3UTR报告基因载体，并共同转染于HEK
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目的:预测并验证对小鼠Foxp3(mFoxp3)有调控作用的miRNAs.通过生物信息学预测可作用于mFoxp3的6个miRNAs，构建其pre-miRNAs表达载体和mFoxp3-3UTR报告基因载体，并共同转染于HEK293T细胞，在细胞内验证miRNAs对mFoxp3的调控作用，进而在mRNA水平和蛋白水平进一步检测miRNAs对mFoxp3的调控作用。
方法:通过生物信息学筛选出可作用于小鼠mFoxp3-3-UTR的miRNA，用重组技术构建psiCHECK-mFoxp3-3-UTR双报告基因载体和pcDNA3.1-pre-miRNA表达载体，psiCHECK-mFoxp3-3-UTR双报告基因载体和pcDNA3.1-pre-miRNA表达载体共同转染HEK293T细胞，或共转染mimic-miRNA和psiCHECK-mFoxp3-3-UTR双报告基因载体，检测报告基因的荧光素酶的荧光强度，验证其对mFoxp3的调控作用。通过Targetscan软件和microRNA.org软件寻找在mFoxp3-3-UTR基因上miRNA的靶基因结合位点，将靶基因进行突变，反向证明miRNA对mFoxp3-3-UTR的调控作用。为进一步确认miRNA对mFoxp3的调控作用，我们进一步构建了带mFoxp3-3-UTR的pcDNA3.1-mFoxp3（pcDNA3.1-mFoxp3/mFoxp3-3-UTR）表达载体，将其与pcDNA3.1-pre-miRNA和mimic-miRNA载体共同转染HEK293T细胞，Real-timePCR检测mFoxp3的mRNA表达水平变化，在mRNA水平上验证miRNA对mFoxp3的调控作用。WesternBlotting检测mFoxp3的蛋白水平变化，在蛋白水平上验证miRNA对mFoxp3的调控作用。
结果:通过对报告基因荧光素酶荧光强度的检测，筛选得到2个对mFoxp3-3-UTR作用明显的miRNA，分别是miR-31和miR-34a进一步分别共同转染miRNA(mimic-miRNA)与相应的mFoxp3-3-UTR靶基因突变体，反向证明miRNA对mFoxp3-3UTR的调控作用，实验数据表明miR-31和miR-34a对mFoxp3的调控作用最为明显。继续验证，分别共同转染pcDNA3.1-mFoxp3/mFoxp3-3-UTR载体和pcDNA3.1-pre-miRNA载体（或mimic-miRNA），数据表明与miRNA共转的mFoxp3在蛋白水平和mRNA水平上发生改变。结果证实，miR-34a和miR-31对mFoxp3的调控作用显著。
结论:成功构建psiCHECK-mFoxp3-3-UTR双报告基因载体，pcDNA3.1-mFoxp3/mFoxp3-3-UTR载体，miRNA靶基因突变体。初步筛选出可调控mFoxp3的miRNA（miR-34a和miR-31），为进一步研究miRNA与Treg细胞之间相关关系奠定了基础。
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