非洲猪瘟(ASF)缺少安全有效的疫苗,目前仅能靠感染猪扑杀和生物安全措施进行控制,因此快速、准确诊断十分重要。血清学检测是ASF实验室诊断和流行病学调查的重要手段,世界动物卫生组织(OIE)推荐的检测方法主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光试验(IFA)和免疫转印试验(Western blot)。其中,ELISA所用抗原从非洲猪瘟病毒(ASFV)感染细胞提取,只能在ASF参考实验室进行。进口 ELISA试剂盒的供应量有限、价格昂贵且检测敏感性不高。虽然国内已有ASFV重组抗原表达的报道,但多数带有组氨酸纯化标签,与组氨酸融合重组亚单位疫苗免疫猪血清存在交叉反应。本研究将ASFV强免疫原性K205R蛋白与类弹性蛋白多肽(ELP)进行融合表达,利用ELP的相变循环(ITC)进行融合蛋白纯化,用烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶活性包涵体切除ELP标签,旨在简化重组抗原制备工艺和避免纯化标签的交叉反应。以两种方式构建了 ELP与ASFV K205R融合表达载体pELP-K205R和pK205R-ELP,转化 BL21(DE3)大肠杆菌后,用 0.2mmol/LIPTG 在 20℃进行诱导表达,结果显示ELP-K205R和K205R-ELP融合蛋白均获得正确表达。对ELP-K205R融合蛋白的相变温度和ITC的盐浓度进行优化,结果显示相变温度为28℃,所需氯化钠为3mol/L,在0.5%Triton X-100存在条件下进行1次ITC,纯化的ELP-K205R融合蛋白纯度大于80%,产量为35mg/L。用TEV蛋白酶活性包涵体切除ELP标签,结果显示K205R-ELP融合蛋白不能切割,ELP-K205R融合蛋白的切割效率大于95%,回收的无标签重组K205R蛋白纯度大于90%。分别用Western blot和ELISA进行鉴定,结果显示重组K205R抗原能被ASFV抗体识别。用ASFV重组K205R抗原建立了 ELISA抗体检测方法,对反应条件进行了系统的优化,结果显示重组K205R抗原的最佳包被浓度为5μg/mL,包被条件为4℃过夜或37℃ 2h;封闭液为含5%脱脂乳粉和0.05%Tween 20的PBS;检测血清的最佳稀释倍数为1:200,孵育条件为37℃ 30min;酶标抗体的最佳稀释倍数为1:10000,孵育条件为37℃ 30min;显色液为TMB,显色条件为室温避光孵育10min;用建立的ELISA对24份ASFV抗体阴性血清进行检测,结果显示OD450平均值为0.066,标准误为0.09,抗体阳性血清的判定阈值为0.156;用重组K205R抗原ELISA和多抗原ELISA试剂盒对116份血清样品进行平行检测,结果显示抗体阳性和阴性血清的检测符合率均为100%。将制备的无标签重组K205R抗原与已有的重组p54、B602L抗原混合,转印杂交膜和经5%脱脂乳粉PBS封闭后制成免疫转印纸条;用制备的免疫转印纸条对116份血清样品进行检测,结果显示48份为ASFV抗体检测阳性,68份为ASFV抗体检测阴性,与两种ELISA的检测总符合率为98.3%。这些研究结果显示制备的无标签重组K205R抗原可用于ASFV抗体的检测。