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研究背景骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种常见的慢性、无菌性、关节炎性疾病。膝关节OA最为多见。OA在全球范围患病率高,治疗难度大,患者需长期忍耐疼痛、活动障碍等症状,随着疾病的进展,患者可发生残疾。OA的以上临床特点给全社会造成了严重的经济负担。因此,对OA发病机制的研究具有很大的价值。近年来学者们普遍认为,滑膜炎症在OA发展的过程中起到重要作用。OA滑膜炎症的主要特点是滑膜成纤维细胞(Fibroblast-like Synoviocytes,FLSs)的异常增生。本课题组前期对FLSs进行基因表达谱芯片分析结果发现,生长特异性阻滞基因1(Growth arrest-specific 1,GAS1)在骨关节炎滑膜成纤维细胞(OAFLSs)中表达下调。GAS1基因的主要作用是抑制细胞增殖、诱导细胞的凋亡。在胚胎发育过程中有重要调控作用,并且参与抑制多种恶性肿瘤的生长、促进肿瘤细胞凋亡。GAS1蛋白是GAS1基因的表达产物,它通过PI3K-Akt等信号通路的介导,调控细胞的增殖及凋亡等生物学特性。由于GAS1在异常增生的OAFLSs中的下调,我们推测GAS1的下调可能与OAFLSs增殖能力及抗凋亡能力的提高相关。MiRNA是一种由20-26个脱氧核苷酸组成的小分子非编码RNA,是重要的转录后水平调节因子,对特定靶基因的表达具有抑制作用。有文献报道,正常或OAFLSs中多种miRNA的表达异常,而在OA环境下,GAS1基因在FLSs中的下调是否由特定miRNA的调控我们也不得而知。目的原代培养获取人源正常及OAFLSs,并比较两者增殖能力的差异;比较正常FLSs与OAFLSs之间、正常与OA滑膜组织之间及正常FLSs用IL-1β刺激前后GAS1的表达差异;构建并验证GAS1高、低表达的FLSs模型;比较GAS1高、低表达的FLSs模型细胞增殖、凋亡等生物学特性的变化;探索GAS1影响FLSs增殖、凋亡特性的分子机制及可能的下游调控通路;进一步探索OA环境下,特定miRNAs下调GAS1基因的分子机制。方法1.运用原代培养技术获取人源正常FLSs和OAFLSs,运用流式细胞仪对FLSs进行分子标记物鉴定;使用CCK-8细胞增殖活性实验检测正常FLSs和OAFLSs的增殖能力的差异;2.使用qPCR、Westernblot、IHC染色等方法验证正常和OAFLSs之间、正常与OA滑膜组织之间以及正常FLSs实施IL-1β刺激前后GAS1的表达差异;3.应用分子克隆、细胞瞬时转染等技术构建GAS1高、低表达FLSs模型并用qPCR、荧光免疫细胞化学染色(Cellular immunofluorescence staining)实验验证其GAS1的表达差异;4.应用CCK-8细胞增殖实验、流式细胞仪细胞周期及凋亡检测验证GAS1的高、低表达对FLSs增殖、凋亡的影响;5.用qPCR、Westernblot等实验方法,探索GAS1调控FLSs增殖、凋亡能力的分子机制及下游分子信号通路;6.结合Targetscan与文献回顾预测可能调控GAS1的潜在miRNA;通过qPCR、Westernblot、荧光素酶报告基因(Luciferase assay)等方法探索miRNA调控GAS1的分子机制。结果1.成功从术中滑膜组织样品中原代培养出人源正常及OAFLSs,并用流式细胞仪检测分子标记物后证实所得FLSs纯度较高,满足后续实验要求;通过CCK-8实验证实了OAFLSs增殖活性高于正常FLSs;2.GAS1基因在OAFLSs的表达低于正常FLSs;对正常FLSs实施IL-1β刺激后GAS1表达水平下降;OA滑膜组织中GAS1表达低于正常滑膜组织;3.正常FLSs转染过表达GAS1重组载体后GAS1表达升高;相反,转染GAS1特异性siRNA后GAS1表达下降;证实了GAS1高、低表达FLSs模型构建成功;4.高表达GAS1能抑制FLSs的增殖活性及诱导其凋亡;相反,低表达GAS1可提高FLS的增殖活性及抗凋亡能力;5.GAS1通过阻断PI3K-Akt通路的活化从而抑制FLS增殖、促进其凋亡;OA炎症环境下,GAS1的下调解除了对PI3K-Akt通路的抑制,从而增强了FLSs的增殖活性及抗凋亡能力;6.在OA环境下,FLSs中miR-34a-5p、miR-181a-5p表达上调;转染miR-34a-5p、miR-181a-5p模拟物可抑制FLSs的GAS1表达。通过荧光素酶报告基因实验证明miR-34a-5p、miR-181a-5p可特异结合GAS1 mRNA的3’UTR进而调控GAS1的表达。结论本章节实验结果证明在OA环境下,由miR-34a-5p、miR-181a-5p介导的GAS1下调,通过影响其下游PI3K-Akt通路的转导,进而引起FLSs增殖活性和抗凋亡能力提高,最终表现为OA炎症环境下的滑膜的异常增生。本课题组的研究结论可为针对OA的新型分子靶向药物的开发提供了一定的理论基础。