白血病是造血干细胞分化过程中成熟障碍、过度增殖及凋亡受阻的造血系统恶性疾病。随着临床化疗新药的出现、化疗药物剂量的调整,急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）的完全缓解率（complete remission,CR）有了明显的提高,但仍有30%左右的患者难以达到CR,且CR后50%～80%的患者最终复发,不能获得CR以及CR后复发的患者极有可能发展为难治性AML,因此亟需寻找新的更有效的治疗方法。AML的治疗在传统化疗的基础上,越来越强调疾病本身的分子学及免疫学特点,以及由此所带来的个体化的靶向及免疫治疗。分子靶向治疗、新型双特异性单抗（bispecific T-cell engagers,Bi TE）、免疫检查点抑制剂、嵌合抗原受体修饰T细胞（chimeric antigen receptor modified T cell,CAR-T）以及造血干细胞移植术等的应用,部分难治/复发性AML可能从中受益,但由于这些治疗费用昂贵、临床试验周期长、部分不良反应较重,使其在临床应用受到一定限制。对老年、体能评分差、合并症较多及难治/复发的AML患者,尚无标准的挽救治疗方案,所以探索高效、经济、不良反应少的挽救治疗方案意义重大。难治/复发AML的中国指南（2017版）以及美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network,NCCN）指南2020.v2版均推荐进行临床试验。从价格低廉且不良反应小的传统药物中开发具有抗白血病作用的“新用途”引起了广泛的关注,其中“老药新用”的研究是一个切入点。AML复发被认为起源于残留的白血病细胞,这些细胞在治疗中存活下来,并且没有被常规的形态学评估发现。新的或更灵敏的方法可以检测这些细胞群体,这些细胞群体被称为可测量残留病（measurable residual disease,MRD）,巩固治疗后MRD持续阴性是AML患者的最佳反应状态,对于MRD持续阳性的患者更应该采取积极的异基因造血干细胞移植术（allo-hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT）,但由于供者、经济等原因部分患者难以进行allo-HSCT,对这部分患者要采取其他的治疗手段尽可能降低MRD水平,延缓疾病的复发。复发目前仍然是AML患者长期无病生存的主要障碍,考虑到复发性AML患者的不良预后,AML患者的维持治疗被提上日程,理想的维持治疗方案是一种患者可以耐受的,能够给患者带来长期缓解且能有效降低复发风险的治疗方案。干扰素（interferon,IFN）具有免疫调节的作用,可激活多种免疫细胞如NK、T细胞、巨噬细胞,能调节抗体的生成,起到增强免疫的作用。另外,它也可通过影响细胞周期阻滞（包括G0/G1、S期阻滞）直接或间接的抑制血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、成纤维细胞生长因子（b-fibroblast growth factor,b-FGF）的基因转录,从而抑制肿瘤血管的生成,间接抑制肿瘤细胞的增殖;IFN还能上调Fas L的表达,从而通过Fas/Fas L途径诱导肿瘤细胞的凋亡,或者通过提高肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）活性、激活caspase系统、调节白介素的活性和改变凋亡调控相关基因的表达等途径诱导肿瘤细胞的凋亡。20世纪80年代有学者应用IFN治疗AML,将IFN用于AML的诱导缓解、维持治疗以及allo-HSCT后复发的挽救治疗中,均取得一定的疗效。白细胞介素-2（interleukin-2,IL-2）是机体免疫网络中重要的免疫调节因子,对多种免疫细胞如T细胞和NK细胞的生长、增殖和分化起重要作用,既往研究称,IL-2单药可用于AML的治疗,但单药治疗疗效欠佳。沙利度胺（Thalidomide）是一种抗血管生成药物,不仅能够降低VEGF、b-FGF的生成,而且能抑制VEGF的协同受体Neuropilin-1的表达,还可以改变肿瘤微环境从而起到抗肿瘤治疗的作用。沙利度胺也是一种免疫调节药,能够增强T、NK细胞以及树突状细胞（dendritic cell,DC）的活性,调节细胞因子比如TNF-α、IFN-γ、IL-2等的分泌。研究结果表明急性白血病患者骨髓中微血管密度显著增高,在AML患者的外周血或骨髓中可检测到高水平的VEGF、b-FGF。近年来,陆续报道沙利度胺对难治/复发性AML有一定疗效。综上所述,干扰素、白细胞介素-2以及沙利度胺对AML均具有一定的疗效,但单独用药疗效有限,那么我们设想三药联合使用能产生协同作用且增强抗AML的治疗效果,本研究将进行探讨。研究内容为:（1）干扰素、白细胞介素-2以及沙利度胺联合治疗AML患者的临床疗效评估;（2）干扰素、白细胞介素-2以及沙利度胺联合治疗AML的作用机制研究。通过以上研究旨在明确三药联合对AML患者的疗效并阐明作用机制,为老年、体能评分差、合并症多及难治/复发的AML、巩固治疗后MRD持续阳性及维持治疗的AML患者提供一种更安全、有效且非化疗的治疗方案。第一部分 干扰素、白细胞介素-2以及沙利度胺联合治疗AML患者的临床疗效研究目的观察干扰素α-1b、白细胞介素-2联合沙利度胺（“干白沙”方案）对难治/复发或体能状态欠佳的AML患者、巩固治疗后MRD阳性以及维持治疗中的AML患者的疗效和不良反应。研究方法1.对2014年01月至2017年06月来自郑州大学附属肿瘤医院等11家医院的难治/复发以及体能状态欠佳不耐受化疗的68例AML患者给予“干白沙”方案治疗,观察其有效率（包括完全缓解率（CR）+完全缓解伴血液学不完全恢复（CRi）+部分缓解（PR））及生存情况。2.对2014年01月至2017年06月期间收治的18例（17例来自郑州大学附属肿瘤医院,1例来自平顶山市第一人民医院）处于血液学缓解但MRD阳性且无法行异基因造血干细胞移植的AML患者应用不同剂量“干白沙”方案,监测其MRD水平变化。3.对2014年01月至2017年06月来自郑州大学附属肿瘤医院等11家医院的MRD阴性的88例AML患者给予维持治疗,同时期巩固治疗结束MRD阴性未给予维持治疗的81例AML患者作为对照,观察其复发率以及复发时间。4.“干白沙”方案的常规治疗剂量及应用方法:沙利度胺起始剂量为每天100mg,睡前顿服,根据患者耐受情况可逐渐增加至每天200mg,同时酌情给予复方丹参片或者阿司匹林片预防深静脉血栓形成;rh IFNα-1b针剂60μg,皮下注射,隔天1次,每次应用前30min给予布洛芬颗粒口服预防其引起的药物性发热,后期如可耐受,可停用退热药物;IL-2针剂100万IU,皮下注射,隔天1次。每4周为1个治疗周期。对伴有FLT3-ITD突变阳性的AML患者给予索拉非尼400mg 2次/天口服。5.“干白沙”方案增加治疗剂量的应用方法:沙利度胺为每天200mg,睡前顿服;rh IFNα-1b针剂60μg,皮下注射,每天1次;IL-2针剂100万IU,皮下注射,每天1次,余同上。6.统计学处理:采用SPSS 21.0统计软件,计量资料满足正态分布时以均数±标准差表示,偏态分布时以中位数±四分位数间距表示。生存时间分析采用Kaplan-Meier法,应用Log-rank对生存曲线的差异进行显著性检验,P﹤0.05为有统计学差异。研究结果1.48例难治/复发AML患者的CR+CRi为14.58%,PR为8.33%,总有效率为22.91%,中位生存时间为6.5个月（1.0～60.0个月）。2.12例体能状态欠佳不耐受化疗的AML患者的CRi为25%,PR为25%,总有效率为50%,中位生存时间为8.0个月（1.0～14.0个月）。3.18例MRD阳性AML患者的总有效率72.2%。根据治疗前MRD水平不同,MRD≥1.0%的患者有效率为57.1%,MRD﹤1.0%的患者的有效率为81.8%。4.88例MRD阴性行维持治疗的AML患者的复发率为12.5%（11/88）,11例患者的中位复发时间为20个月。对照组81例MRD阴性未行维持治疗的AML患者的复发率为54.3%（44/81）,44例患者的中位复发时间为6个月。第二部分 干扰素、白细胞介素-2以及沙利度胺对AML的作用机制研究研究目的1.观察干扰素以及沙利度胺对AML细胞的促凋亡和增殖抑制作用并探讨机制;2.观察干扰素、白细胞介素-2以及沙利度胺治疗对AML患者免疫功能的影响;3.建立AML异种移植小鼠模型,体内观察干扰素、白细胞介素-2以及沙利度胺对AML的疗效,探讨作用机制。研究方法1.CCK-8法检测干扰素、沙利度胺对AML细胞株U937、THP-1、OCI-AML3的增殖抑制作用。2.流式细胞术检测干扰素、沙利度胺单药及联合作用对AML细胞株U937、THP-1、OCI-AML3的凋亡、周期及线粒体膜电位的影响。3.Western blot检测干扰素、沙利度胺单药及联合作用对AML细胞株U937、THP-1、OCI-AML3的凋亡、周期信号通路蛋白表达的影响。4.收集2016年03月至2019年05月来自郑州大学附属肿瘤医院等11家医院收治的初治不耐受化疗的或复发/难治性的或行维持治疗的且自愿接受干扰素α-1b、白细胞介素-2联合沙利度胺方案治疗的68例AML患者,采集患者用药前至少1天以及规范治疗用药3个月后的空腹晨起外周血标本,流式细胞术检测患者外周血淋巴细胞亚群以及NK细胞的Granzyme-B及Perforin的表达水平;微量样本多重定量技术（cytometric bead array,CBA）检测患者血浆中VEGF、INF-γ、TNF-α、IL-6等4种细胞因子的表达水平。对照组为来自郑州大学附属肿瘤医院体检中心的35例健康体检者。5.利用白血病细胞系MOLM-13在重度免疫缺陷小鼠（NCG）中建立AML疾病模型。观察药物作用前后小鼠体内白血病负荷的变化、小鼠的生存期,观察药物作用后小鼠外周血T淋巴细胞亚群、T淋巴细胞中颗粒酶B、穿孔素的表达以及DC的变化情况。6.采用SPSS 21.0统计软件,计量资料满足正态分布时以均数±标准差表示,偏态分布时以中位数±四分位数间距表示;药物处理前后实验数据比较采用配对t检验,多个均数比较采用方差分析,生存时间分析采用Kaplan-Meier法,应用Log-rank对生存曲线的差异进行显著性检验,P﹤0.05为有统计学差异。研究结果1.干扰素、沙利度胺单药均能抑制U937、THP-1、OCI-AML3细胞的增殖,且两药联合后增殖抑制作用增强。2.干扰素、沙利度胺单药均能促进U937、THP-1、OCI-AML3细胞的凋亡,且呈浓度依赖性,两药联合后促凋亡作用进一步增强。3.干扰素、沙利度胺两药联合后AML细胞周期阻滞在G1期。4.干扰素、沙利度胺单药均能降低U937、THP-1、OCI-AML3细胞的线粒体膜电位,两药联合后此作用进一步增强。5.干扰素、沙利度胺联合后,U937、THP-1、OCI-AML3细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1表达减少,促凋亡蛋白Bak、cf-PARP和细胞色素C表达增多,周期抑制蛋白P21表达增多,周期蛋白c-Myc表达减少。6.与对照组相比:治疗前患者外周血的CD4+/CD8+、NK细胞的比例、NK细胞的Perforin及Granzyme-B的表达水平均较对照组低,外周血血浆中的VEGF、IL-6及TNF-α细胞因子水平较对照组高,差异有统计学意义;INF-γ细胞因子的水平较对照组低,差异无统计学意义。7.“干白沙”方案规范治疗3个月后,患者外周血的CD4+/CD8+比例、NK细胞的比例、NK细胞的Perforin及Granzyme-B的表达水平均较治疗前升高,外周血血浆中的INF-γ细胞因子水平较前升高,VEGF细胞因子水平较治疗前下降,差异均具有统计学意义;外周血中CD3+CD4+及CD3+CD8+的淋巴细胞比例以及血浆中TNF-α细胞因子水平较前升高,IL-6水平较前降低,差异无统计学意义。8.成功建立AML移植小鼠模型。干扰素、白细胞介素-2以及沙利度胺单药均具有抗白血病效应,延长小鼠生存期,联合作用后抗白血病效应进一步增强。9.干扰素、白细胞介素-2以及沙利度胺单药作用于小鼠后,小鼠外周血中CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞和DC较对照组增多;外周血T淋巴细胞中Perforin及Granzyme-B的表达水平均较PBMC组升高,“干白沙”联合组作用更显著,与单药组和对照组比均具有统计学差异。结论1.“干白沙”方案对逆转微小残留病阳性的AML疗效显著;对部分难治/复发和初治AML患者有一定疗效,能使一部分患者获得缓解,延长患者的生存期。2.“干白沙”方案可用于AML患者的维持治疗,延长患者生存。3.“干白沙”方案通过提高机体细胞免疫和降低VEGF的分泌,增强AML患者机体抗白血病能力。4.干扰素联合沙利度胺可协同抑制AML细胞增殖、诱导凋亡,使细胞周期阻滞在G1期。5.“干白沙”联合作用可显著减少AML异种移植小鼠肿瘤负荷,延长生存期。