延边黄牛作为我国五大地方良种牛之一,是不可多得的具有我国特色的肉牛品种,极具国际市场潜力,目前延边黄牛产业已经形成独具特色的区域经济优势。近年来它的保种选育工作要求越来越大的科技投入,为了加快其改良进程,提高选种选育效率,我们引入了体细胞克隆技术,通过该技术能在短时间内生产出大量品质均一、性能优良的个体,可以大大提高生产水平,加快延边黄牛遗传育种工作的进程。为了这项工作的顺利开展,对其技术路线中的关键环节—融合、激活作进一步的改进和完善,从而保障该技术在延边黄牛保种选育工作中的成功应用。本研究采用延边黄牛耳皮肤成纤维细胞作为供核细胞,MⅡ期去核卵母细胞作受体细胞,挤压法去核,卵周隙内注核,探讨不同的融合、激活液成分对延边黄牛体细胞克隆效率的影响,探寻适宜延边黄牛体细胞克隆的最适的融合、激活液。实验结果以融合率、卵裂率、8-16细胞发育率和囊胚发育率来评定。研究结果如下:1.融合液中添加7.5μg/mLCCB的融合率是最高的,(81.04%,p＜0.05),显著高于对照组和5.0μg/mL组,与10.0μg/mL组差异不显著;7.5μg/mL组的卵裂率、8-16cell率和囊胚发育率显著高于其他三组(92.49%,45.03%,26.96%,p＜0.05)。结果表明,融合液中添加CCB的最佳浓度是7.5μg/mL。2.融合液中添加7.5 mM咖啡因的融合率(80.33%,p＜0.05),显著高于对照组,与其他两组差异不显著;卵裂率和囊胚发育率显著高于对照组和2.5 mM组,与5.0 mM组均差异不显著(87.02%,22.70%,p＜0.05)。结果表明,融合液中添加咖啡因的最佳浓度是7.5mM。3.确定了融合液中CCB和咖啡因的最佳浓度后,将二者联合添加,我们得到:单独添加CCB组和单独添加咖啡因组的融合率、卵裂率、8-16cell率及囊胚发育率均显著高于联合添加组(83.06%和81.12%,89.04%和87.71%,41.25%和40.41%,24.14%和22.33%,p＜0.05)。结果表明,单独添加CCB或单独添加咖啡因都明显好于联合添加组。4.激活液中添加5.0μg/mLCCB的卵裂率(87.20%,p＜0.05),显著高于对照组和7.5μg/mL组,与2.5μg/mL组差异不显著;5.0μg/mL组的8-16cell率和囊胚发育率显著高于显著高于其他三组(49.02%,28.16%,p＜0.05)。结果表明,激活液中添加CCB的最佳浓度是5.0μg/mL。5.激活液中添加5.0 mM咖啡因的卵裂率和8-16cell率是最高的(85.45%,42.22%,p＜0.05);5.0 mM组的囊胚发育率(20.55%,p＜0.05),显著高于2.5 mM组和7.5 mM组,与对照组差异不显著。结果表明,激活液中添加咖啡因的最佳浓度是5.0 mM。6.确定了激活液中CCB和咖啡因的最佳浓度后,将二者联合添加,我们得到:单独添加CCB组和联合添加组的卵裂率和囊胚发育率均显著高于对照组和单独添加咖啡因组(86.83%和88.03%,24.44%和26.92%,p＜0.05)。结果表明,激活液中单独添加CCB或联合添加CCB和咖啡因的效果最好。7.确定了融合、激活液各自的最佳添加方案后,进行相互组合,我们得到的结论是:融合液中添加CCB+激活液添加CCB的组合、融合液中添加咖啡因+激活液中添加CCB的组合以及融合液中添加CCB+激活液中联合添加CCB和咖啡因的组合方案均可应用到延边黄牛体细胞克隆胚发育的融合、激活体系中。