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目的:近年来国外的研究发现以18-羟皮质醇(18-OHF)为代表的类固醇激素在醛固酮瘤(APA)患者外周血中明显升高,由于此型患者可通过手术治愈或缓解,有学者认为类固醇激素有望成为早期识别APA的生物标志物,用于筛选真正需要行肾上腺静脉取血(AVS)分型定侧的原发性醛固酮增多症(PA)患者。进一步的研究发现血浆类固醇的升高与KCNJ5基因突变特异性相关联,可能与肾上腺病变组织球状带和束状带样细胞及其酶系表达的程度及差异有关。目前国人的血浆类固醇水平与不同亚型PA及体细胞突变的关系尚不清楚。本研究拟采用液相色谱-质谱法(LC-MS/MS)测定待分型的可疑单侧型PA患者的血浆18-OHF浓度,与金标准AVS分型结果进行比较,初步评价血浆18-OHF对原发性醛固酮增多症(PA)分型诊断的价值;同时测定手术患者肾上腺病变组织的体细胞突变,进一步分析血浆18-OHF与体细胞突变的关系。为此,1.首先,建立LC-MS/MS定量分析测定血浆18-OHF浓度的方法。2.研究血浆18-OHF水平与不同亚型PA的关系及其对单侧型PA的诊断价值。3.明确目前已报导的5种体细胞突变(KCNJ5、ATP1A1、ATP2B3、CACNA1D、CTNNB1)的常见突变位点在手术PA患者中的发生率及其相应的临床表型。4.研究血浆18-OHF水平与体细胞突变的关系。方法:1.通过查阅文献,确定LC-MS/MS测定血浆18-OHF浓度的实验方法、条件及技术路线。收集2016年12月在新疆自治区人民医院高血压诊疗中心确诊为PA并经过AVS分型诊断的PA患者血样10份(包括外周血样及肾上腺静脉血样),采用5500 QTRAP质谱仪(AB SCIEX)进行预实验,建立LC-MS/MS测定血浆18-OHF的方法,并进行方法学验证评价其灵敏度、精密度及专属性。2.继续纳入2017年1月至12月在我中心定性诊断为PA、结合肾上腺CT结果疑似为单侧的待分型PA患者,以AVS为金标准进行分型诊断,同时收集研究对象的外周血样,采用预实验成功建立的LC-MS/MS方法测定其外周血18-OHF浓度,分析血浆18-OHF水平与不同亚型PA的关系及其对单侧型PA的诊断价值。3.(1)收集35例手术PA患者的肾上腺瘤体或增生组织,保存于液氮罐中,提取组织DNA,通过设计的6对引物,对目标基因KCNJ5、ATP1A1、ATP2B3、CACNA1D、CTNNB1-区段1、CTNNB1 exon3六个片段进行PCR直接测序,分析这些片段中的突变位点及其相应的临床表型。(2)分析35例手术患者血浆18-OHF浓度与体细胞基因突变的关系。结果:1.预实验建立的LC-MS/MS测定血浆18-OHF浓度的方法具有较好的灵敏度、精密度及专属性,能够对血浆18-OHF进行定量分析,样本制备重复性好,数据稳定可靠,为进一步开展后续研究奠定了坚实基础。2.共纳入45例可疑为单侧型的待分型PA患者,经金标准AVS分型诊断:24例为单侧型PA、21例为双侧型PA。(1)与双侧型PA患者相比,单侧型PA患者的血钾水平较低(3.21±0.45 vs 3.47±0.34 mmol/L,P=0.038);血浆醛固酮浓度(PAC)较高(26.6±8.0vs 21.5±8.8 ng/dL,P=0.051),差异接近统计学意义;两组间年龄、性别比例、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、体重指数(BMI)、醛固酮/肾素活性比值(ARR)、血浆肾素活性(PRA)、空腹血糖、血钠及血肌酐水平无统计学差异(P>0.05)。(2)Spearman相关分析显示:PA患者的血浆18-OHF浓度与ARR呈正相关(r=0.37,P=0.013),与PRA(r=-0.32,P=0.034)及血钾(r=-0.31,P=0.04)呈负相关。(3)血浆18-OHF浓度在单侧型PA患者中明显高于双侧型PA患者[2.16(0.73,3.66)vs 0.78(0.14,1.15)ng/mL,P=0.001]。(4)采用二元Logistic回归分析患者年龄、性别、血钾水平、PAC及血浆18-OHF浓度与单侧型PA的关系,结果显示:血浆18-OHF(OR=4.24,P=0.007)、血钾(OR=0.04,P=0.034)对单侧型PA有统计学意义;而PAC、ARR、年龄、性别无统计学意义;提示血浆18-OHF浓度每增加1ng/mL其为单侧型PA的优势比为4.24。(5)ROC曲线分析显示血浆18-OHF诊断单侧型PA的曲线下面积(AUC)为0.806,最佳切点为1.74 ng/mL,敏感性为65.2%,特异性为90.5%,约登指数(YI)为0.557,阳性似然比为6.8,其诊断效能优于经典指标PAC(AUC=0.710,敏感性为73.9%,特异性为66.7%,阳性似然比为4.1)及ARR(AUC=0.588,敏感性为69.6%,特异性为57.1%,阳性似然比为1.6)。(6)以上述血浆18-OHF最佳切点作为分型标准与金标准AVS分型结果进行比较,其阳性预测值为88.2%,阴性预测值为70.3%,两种分型方法的Kappa值为0.55,P<0.001,提示两种方法诊断结果的一致性为中等。3.对35例手术PA患者肾上腺组织的KCNJ5、ATP1A1、ATP2B3、CACNA1D、CTNNB1-区段1、CTNNB1 exon3六个片段进行PCR直接测序分析。(1)基因测序结果:(1)11例PA患者存在KCNJ5基因错义突变(4例G151R,7例L168R),总突变率为31.4%;(2)8例患者存在CACNA1D基因rs117630105 C/T突变,突变率为22.9%;(3)未发现ATP1A1、ATP2B3、CTNNB1-区段1,CTNNB1 exon3片段存在突变位点。(2)基因突变与临床表型的关系:(1)KCNJ5基因突变型患者中单侧型PA的比例明显高于野生型患者(81.8%vs 45.8%,P=0.049)。KCNJ5突变型患者与野生型相比,其性别比例、年龄、SBP、DBP、PRA、PAC、血钾、24小时尿钾、ARR及肿瘤直径等指标无统计学差异(P>0.05);(2)CACNA1D基因突变患者中3例为双侧型PA,5例为单侧型PA,7例为女性,1例为男性,年龄明显小于野生型(44.3±6.2 vs 51.9±8.6岁,P<0.05),两组间SBP、DBP、PRA、PAC、血钾、24小时尿钾、ARR及肿瘤直径无统计学差异(P>0.05)。(3)血浆18-OHF浓度与基因突变的关系:(1)KCNJ5基因突变患者的血浆18-OHF浓度明显高于野生型[1.95(1.19,2.70)vs 0.73(0.42,1.41)ng/mL,P=0.034];(2)CACNA1D基因突变患者的血浆18-OHF浓度与野生型相比无统计学差异[0.59(0.32,2.70)vs1.15(0.60,2.16)ng/mL,P=0.516];(3)以血浆18-OHF>1.74ng/mL为切点,将患者分为高18-OHF组与低18-OHF组,KCNJ5突变在高18-OHF患者中的比例明显高于低18-OHF患者(58.3%vs 18.2%,P=0.017)。而CACNA1D突变比例在两组间无明显差异(25.0%vs 22.7%,P=1.0)。结论:1.本研究成功建立了LC-MS/MS测定血浆18-OHF浓度的方法,具有较好的灵敏度及专属性,能够对血浆18-OHF进行绝对定量,样本制备重复性好,数据稳定可靠,为进一步开展后续的研究奠定基础。2.血浆18-OHF浓度在单侧型PA患者中明显高于双侧型PA患者;与金标准AVS相比,血浆18-OHF对单侧型PA具有一定的诊断价值,但由于样本量小,还需扩大样本量进一步在PA患者中验证。3.35例PA患者中发现KCNJ5基因G151R、L168R突变率为31.4%,CACNA1D基因rs117630105 C/T突变率为22.9%;未发现ATP1A1、ATP2B3、CTNNB1突变。4.血浆18-OHF浓度的升高与KCNJ5基因突变有关,未发现该指标与CACNA1D基因突变存在相关性。