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原位肝脏移植是目前治疗终末期肝病唯一有效的手段，而供体肝脏的匮乏和免疫排斥反应限制了该治疗方法在临床上的广泛应用。近年来，肝细胞移植作为原位肝脏移植的替代治疗方案在临床上取得了一定的治疗效果。然而，用于细胞移植的供体肝细胞也存在着自身的局限性，如同样受制于供体的缺乏，成熟肝细胞在体外存活期短，难以大量扩增，且随着培养时间的延长肝细胞的功能逐渐降低，以及在慢性损伤的受体肝脏（如肝硬化）内，外源成熟肝细胞的增殖受到抑制等。因此，寻找合适的、新的供体细胞来源是肝细胞移植研究的重要任务之一。肝干细胞具有自我更新能力，并可分化为成熟的肝细胞和胆管上皮细胞。诱导型肝干细胞（induced hepatic stem cell，iHepSC）是本实验室通过谱系重编程的方法将小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）诱导转分化而获得的具有肝干/前体细胞特性的细胞。实验证明，iHepSC在体外培养过程中保持了较强的增殖能力和正常的核型，在体内和体外能够被诱导分化为成熟的肝细胞和胆管上皮细胞，并可再殖损伤的肝脏，而且不具有形成肿瘤的能力。因此，采用谱系重编程技术所产生的诱导型肝干细胞为临床上肝脏疾病的细胞治疗提供了一个新的供体细胞来源。然而，目前对这种诱导型肝干细胞的干性维持机制尚缺乏认识，而这是iHepSC进入临床应用需要解决的问题之一。为了认识肝干细胞干性维持的调控机制，本课题通过单细胞RNA测序技术比较了肝干细胞和分化细胞之间的基因表达差异，并重点比较了转录因子的表达水平，获得了五个表达差异最为显著的转录因子：Pitx2、Twist1、Stat3β、TSC22d1和GATA6。在此基础上，本课题重点研究了Pitx2（Paired-likehomeodomain transcription factor2，配对样同源转录因子2）和Twist1（The BasicHelix-loop-helix (bHLH) transcription factors，碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子）在iHepSC中对肝干细胞干性维持的作用。在本研究中，利用shRNA慢病毒干扰的载体获得了Pitx2和Twist1基因稳定沉默的iHepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1细胞株。通过比较基因沉默前后诱导型肝干细胞的干性相关的基因、自我更新能力和分化潜能，系统地分析了转录因子Pitx2和Twist1在诱导型肝干细胞中对干性维持的作用。当Pitx2和Twist1基因分别沉默后，iHepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1细胞在形态上未见明显改变。接下来本研究应用RT-PCR对iHepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1细胞中肝干细胞标志物的表达进行了分析。结果表明，肝干细胞的基本标志物，如肝细胞的分子标志白蛋白（Albumin，Alb）、胆管细胞的分子标志细胞角蛋白19（Cytokeratin-19，CK19）和未成熟肝细胞的分子标志甲胎蛋白（α-Fetoprotein，Afp）在iHepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1细胞中的表达均有一定程度的降低。肝干细胞的另两个重要分子标志Lgr5和EpCAM在iHepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1细胞中的表达明显减弱，而iHepSC中高表达的肝干细胞重要分子标志Sox9在iHepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1细胞中没有表达，进一步的免疫细胞化学分析从蛋白表达水平也证明了Lgr5、EpCAM和Sox9的表达变化。肝干细胞干性相关标志物表达的变化提示我们，分别沉默转录因子Pitx2和Twist1后，对iHepSC的干性维持产生了一定程度的影响。肝干细胞的基本特征首先是具备一定的自我更新能力。对iHepSC与iHepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1细胞的增殖特性进行比较，HepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1细胞的克隆形成能力显著降低，细胞增殖实验CCK8结果显示，iHepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1细胞在24小时和48小时的增殖速度明显低于iHepSC，其差异具有统计学意义。Brdu和Ki67等细胞增殖指标也同样显示，iHepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1细胞在24小时和48小时的Brdu、Ki67阳性细胞的数目显著少于iHepSC。这些结果说明Pitx2和Twist1能够显著降低iHepSC的增殖能力，即自我更新能力。肝干细胞的另一基本特征是具有肝向和胆向分化的潜能。我们对Pitx2和Twist1分别沉默后，iHepSC是否发生自发分化进行了初步分析。通过检测肝向分化分子标志αAT、TAT和TTR，胆向分化标志NCAM、CK7和ChromA，成熟肝细胞分子标志G6P、Cyp7a1和Cyp3a11。结果显示：Pitx2和Twist1表达沉默后，iHepSC没有向任一方向分化的趋势。说明在未改变细胞培养环境和不处于特定的诱导分化条件下，Pitx2和Twist1可能不是促进iHepSC双向分化的主要原因，Pitx2和Twist1对诱导型肝干细胞分化功能的影响还需要更进一步的研究。由于MEFs在向iHepSC转分化的过程中发生了间质向上皮的转变（mesenchymal-epithelial transition, MET）。因此，本研究检测了Pitx2和Twist1转录因子分别沉默后的iHepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1细胞上皮间质分子标志的变化。结果发现：iHepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1细胞的上皮分子标志Claudin、N-Cadherin、E-Cadherin和β-Catenin的表达减弱，而间质分子标志Snail、Slug和Vimentin的表达明显增强。说明Pitx2和Twist1沉默后iHepSC具有向间质细胞转化的趋势。本课题首次对转录因子Pitx2和Twist1对诱导型肝干细胞干性维持的作用进行了研究。iHepSC在转录因子Pitx2和Twist1分别沉默后，其自我更新的能力下降，肝干细胞干性分子标志表达减弱或消失，且iHepSC具有向间质细胞转化的趋势。这些结果表明转录因子Pitx2和Twist1对诱导型肝干细胞干性维持起着重要的作用，但其对iHepSC分化作用的影响还需要更加深入的研究。本研究所建立的iHepSC-Sh-Pitx2和iHepSC-Sh-Twist1基因稳定沉默的细胞株，可以作为肝干细胞干性维持研究的细胞模型，同时该研究也为肝干细胞干性维持的调控机制和肝脏疾病的细胞治疗研究提供了新的线索。