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研究目的：探讨慢病毒介导的CDK8基因的稳定沉默在体外和活体水平对结肠癌细胞生长的影响，并阐明其分子机制。方法:1.表达luciferase的结肠癌细胞株的构建将PRC/CMV2-luc真核表达质粒转染SW480细胞，经G418筛选获得稳定表达luciferase的SW480-luc细胞单克隆，挑取单克隆并传代，中间每5代检测一次luciferase的活性，并淘汰luciferase活性低的克隆。一直传代至40代，并比较所建立的稳定表达luciferase的SW480-luc细胞与母细胞SW480的生长特性。2.制备表达针对CDK8基因的shRNA的慢病毒并感染SW480-luc细胞，并筛选得到稳定沉默CDK8基因的单克隆细胞。制备表达针对CDK8基因的shRNA的慢病毒，并感染SW480-luc细胞，然后加嘌呤霉素筛选，挑取单克隆，并建立稳定沉默CDK8基因的克隆shCDK8及阴性对照的克隆mock；然后分别用荧光定量PCR和western blotting检测CDK8基因在mRNA和蛋白水平的沉默效率。3.检测CDK8基因的稳定沉默在体外和活体水平对结肠癌细胞生长的影响，并探讨其分子机制。首先用MTT法检测沉默CDK8基因的克隆的细胞增殖，再用荧光定量PCR检测CDK8所调控基因如c-Myc和MMP-7的表达；将稳定沉默CDK8基因的shCDK8细胞及阴性对照的mock细胞分别接种在裸鼠的左右前肢腋下，然后用活体成像系统连续观察肿瘤的生长。结果:1.建立了四株稳定高表达luciferase的结肠癌细胞株SW480-luc，并比较了其与母细胞SW480的生长特性。发现其生长特性与母细胞无明显差别。2.获得稳定沉默CDK8的细胞克隆及阴性对照克隆各三个，分别命名为shCDK8-1、shCDK8-2、shCDK8-3,阴性对照克隆分别命名为mock-1、mock-2、mock-3。shCDK8克隆相对于SW480的沉默效率为沉默效率分别为74.7%，71.3%，68.5%，而蛋白水平也有明显下调；而mock克隆的CDK8基因相对于SW480-luc在mRNA的表达分别为1.04，1.08和0.96。3.用MTT法连续观察五天shCDK8克隆和mock克隆生长情况，可见shCDK8的三个克隆的增殖速度与mock三个克隆相比明显减慢；用荧光定量PCR检测CDK8基因所调控的β-catenin、c-Myc和MMP-7基因的表达，发现β-catenin、c-Myc和MMP-7的表达也有明显下调；将shCDK8-1细胞和mock-1细胞分别接种在裸鼠的左右前肢腋下，可见沉默组的肿瘤生长明显比阴性对照组慢。4.免疫组化结果显示沉默组肿瘤组织中CDK8基因明显下调，荧光定量PCR结果显示沉默组肿瘤组织中CDK8、β-catenin, c-Myc and MMP-7基因明显下调。结论：1.重组shRNA慢病毒可显著下调CDK8基因的表达。2. shRNA慢病毒感染SW480细胞沉默CDK8基因后，能显著抑制细胞的增殖，并且下调c-Myc、MMP-7基因的表达。3. shRNA慢病毒感染SW480细胞沉默CDK8基因后，能显著抑制SW480在裸鼠体内的生长。CDK8基因有望成为结直肠癌靶向基因治疗的新靶点。