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研究背景和目标:近年来,随着生命科学研究的飞速进展,恶性肿瘤细胞内的信号转导、细胞周期的调节、细胞凋亡的诱导、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等各种基本过程正在被逐步阐明。为抗癌药物的研制提供了新的契机。研究表明大多数肿瘤的发生、发展及转移均与多种酪氨酸激酶的过表达有着密切的关系。然而,不论是正常的基因还是癌基因编码的蛋白酪氨酸激酶在与下游蛋白相互作用时都需要共同的结构单元-Src家族同源结构域2和3(Src homology domain,SH2&SH3)。两者通过介导酪氨酸激酶与含有磷酸化酪氨酸序列的蛋白分子相互作用从而参与许多重要的细胞信号转导过程。正是由于SH2和SH3介导的蛋白结合在多种酪氨酸激酶始动的细胞增殖信号中发挥着重要作用,因此Src家族同源结构域正逐渐成为新的抗肿瘤治疗靶位点。基于相关研究背景,我们将PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白应用于荷肝癌HepG-2肿瘤裸鼠的治疗性研究,探讨该蛋白对肝癌HepG-2肿瘤生长的体内抑制作用以及对裸鼠生存期的影响。以相似的蛋白构建原则构建含有Grb2-SH2的原核表达载体,表达并纯化含有TAT48-60(GRKKRRQRRRPPQ)序列的His-PTD-Grb2-SH2融合蛋白。将His-PTD-Grb2-SH2融合蛋白应用于体外功能实验初步探讨其生物学活性。从而为以Src家族同源结构域作为抗肿瘤靶位点的研究提供新的实验依据。研究方法:我们选择Balb/C裸鼠通过肢体单侧皮下分别接种1×106 HepG-2细胞构建裸鼠荷肝癌HepG-2肿瘤模型,然后将PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白采用局部注射的方式干预肿瘤生长并影响裸鼠的生存时间。另一方面我们采用PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白设计原理,构建融合蛋白表达载体,将编码Grb2-SH2结构域的cDNA导入pET-16b-PTD原核表达载体,表达并纯化同时含有蛋白转导结构域和Grb2-SH2结构域的融合蛋白--His-PTD-Grb2-SH2,经Western-blot鉴定后将该融合蛋白用于初步的体外实验研究。通过免疫荧光方法鉴定His-PTD-Grb2-SH2融合蛋白是否能够顺利通过细胞膜,光镜观察该蛋白对于细胞的形态学影响,MTT(噻唑蓝)法测定细胞生长曲线和细胞生长抑制率进一步研究该蛋白在体外对于细胞的增殖的影响。研究结果:在对荷肝癌细胞系HepG-2肿瘤裸鼠的治疗性研究中,PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白表现出显著的抗肿瘤效应。该蛋白能够明显抑制肿瘤生长,实验组肿瘤体积明显小于对照组,在生存时间上该蛋白的应用明显有益于荷瘤裸鼠的生存期延长。在以SH2结构域为靶位点的研究中,通过基因重组技术我们成功构建,经过酶切鉴定及测序结果证实获得含有Grb2-SH2结构域的原核表达载体。经过表达、纯化及Western-blot鉴定,我们得到了一种全新的融合蛋白His-PTD-Grb2-SH2。体外研究表明,该蛋白能够顺利通过乳腺癌SKBR-3细胞和胃癌SGC-7901细胞的生物膜结构分布在胞浆及细胞核内,MTT(噻唑蓝)法测定细胞生长曲线和细胞生长抑制率进一步证明该蛋白在体外对于两种肿瘤细胞的增殖有着明显的抑制作用。结论:以Src家族同源结构域作为抗肿瘤靶位点的研究中,我们采取全新思路,通过直接将SH2和SH3结构域导入细胞内竞争结合相应的底物位点从而干扰细胞信号转导途径获得成功。在体内研究中PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白通过诱导肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤生长并延长荷瘤裸鼠的生存期。His-PTD-Grb2-SH2在体外研究中也表现出穿膜特性及肿瘤生长抑制作用。这些研究为深入探讨以Src家族同源结构域作为抗肿瘤靶位点的研究提供了新的实验证据。