活的非可培养状态(Viable but nonculturable state, VBNC)是细菌的一种特殊存在形式，时至如今，已经有60多种细菌被证实可进入VBNC状态。VBNC状态是细菌在面临生存压力时采取的一种自我保护策略。在VBNC状态下，细菌保持细胞活性，但在常规方法培养条件下不能生长繁殖，而在一定的条件下又能复苏、恢复可培养性。一些病原菌在VBNC状态下仍能表达出毒性，而由于VBNC菌无法被传统培养方法检测出来，因此，VBNC菌尤其是致病菌的VBNC菌对食品安全造成潜在的威胁。单增李斯特菌是一种典型的食源性致病菌，在一些肉类及肉制品中最常见。但目前，对于VBNC状态的单增李斯特菌在肉类中的生长行为，国内外尚无相关报道。以初始浓度为107CFU/mL的单增李斯特菌为VBNC诱导对象，对诱导过程中细菌总数、活菌数、可培养数进行监测，证实在2℃、pH6.0条件下该菌进入VBNC状态。同时，通过荧光染色与显微镜观察，发现单增李斯特菌进入VBNC状态后，菌体形态与体积发生变化，菌体之间具有聚集倾向。诱导结束后，分别将正常状态以及VBNC状态的单增李斯特菌接种在4℃冷鲜肉中进行培养，对其生长行为进行监测。结果表明，正常的单增李斯特菌能在4℃的冷鲜肉下保持生长，经过13天到达平台期，并在肉块表面形成肉眼可见的菌落；VBNC菌在培养期第3天恢复可培养性，在第14天到达生长平台期，并在肉块表面产生一层湿润的、密布的粉红色菌膜。PMA-qPCR法测定的、两种培养样本中的活菌数量变化趋势均与总菌数、可培养数变化情况相符，但PMA-qPCR法测得的活菌数量低于其他三种方法的检测结果，如培养结束后，通过PMA-qPCR法测定的两个培养样本中的活菌数量分别为2.9×107CFU/g和1.4×107CFU/g，低于qPCR、平板计数法及流式细胞术的检测结果（依次为5.6×107CFU/g和2.4×107CFU/g，5.3×107CFU/g和2.5×104CFU/g，5.4×107CFU/g和2.3×107CFU/g），推测是由于细菌收集过程中的多次离心造成部分活菌的菌体损伤所致，因为PMA-qPCR法以细胞膜完整性作为判断死、活细胞的标准。目前对“活细胞”概念的判断标准尚不统一，以细胞的膜的完整性来对死、活细胞进行区分检测的PMA-qPCR技术，理论上能适用于对活菌（包括VBNC菌）的检测。但对于一些具有膜完整性的死细胞或具有可逆性膜损伤的活细胞，该方法在检测原理上仍有缺陷。本研究在PMA-qPCR技术基础上，设计出一种对生物代谢活性敏感的核酸荧光染料TOMA，以求建立一种利用生物代谢活性作为活菌判断标准的活菌分子检测技术。TOMA分子主要由结合基团、交联基团以及生物连接臂三个功能基团构成。通过质谱、核磁共振氢谱表征TOMA的分子量及分子结构无误(分子量为474.6)。菌体经过终浓度为10μg/mL的TOMA处理后，发出强烈的绿色荧光，说明TOMA分子能够自由穿透细菌壁膜，进入所有细菌菌体内与DNA进行良好的结合。TOMA分子上连接的酯键对酯酶活性表现敏感，可在短时间内被脂肪酶水解，体外实验中脂肪酶的最佳酶量为1.0U/μmoL TOMA，此时TOMA的降解率达到83%以上，说明TOMA分子结构上的酯键能实现预期功能。在0~10μg/mL浓度范围内，TOMA对DNA在PCR反应中扩增的抑制效果与TOMA浓度呈正相关，终浓度为10μg/mL的TOMA对DNA扩增有明显的抑制作用，验证了TOMA分子能抑制DNA在PCR反应中的扩增。通过与PMA-qPCR法对比检测分别经热灭活、70%异丙醇以及紫外照射处理的死菌，证实建立的TOMA-qPCR新型活菌检测方法对三种灭活菌均能进行有效的区分，对于具有膜完整性的死菌，能有效抑制其DNA在PCR反应中的扩增，从而实现定量检测活菌的目的。