果梅PmARF基因的克隆及功能分析

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果梅(Prunus mume Sieb.et Zucc.)原产于中国,为蔷薇科李属植物。梅花具很高的观赏价值,梅果实营养丰富。果梅中雌蕊败育现象严重,并且严重影响果梅产量。本研究通过生物信息学方法鉴定和识别了梅基因组中ARF基因家族,并通过荧光定量PCR技术,初步探究ARF基因家族在果梅花芽雌蕊发育形态中的影响作用,进而利用国家果梅种质资源圃果梅品种’大嵌蒂’为试材,通过RT-PCR技术,分离克隆了果梅PmARF11基因。将PmARF11基因转化模式植物烟草对其功能进行初步鉴定。主要研究结果如下:1梅PmARF基因家族的识别和鉴定。植物生长和发育的各个生理过程都受到生长素的影响,尤其是对花器官的发育过程,生长素影响作用更为显著。植物ARF转录因子是生长素信号转导途径中的重要调控因子。尽管ARF基因家族已经在很多物种中被研究,但有关果梅ARF基因家族的信息还很少。本论文着重分析了梅基因组中ARF基因家族,包括染色体定位,进化树分析,基因结构,蛋白结构以及亚细胞定位预测的分析。研究结果显示,在果梅基因组中,共鉴定出17个PmARF基因成员,并根据ARF基因家族的系统发育和结构特点,将其分为6大类。此外,为了进一步探究生长素在植物花发育过程中分子机制,特别是PmARF基因对雌蕊发育的调控机理,本文通过实时荧光定量PCR技术,对果梅品种’大嵌蒂’的完全花芽和不完全花芽进行了部分PmARF基因的表达分析。研究结果初步阐明了PmARF1 基因与果梅雌蕊发育之间有着密切联系,并为在木本植物中进一步的探索ARF转录因子家族鉴定了基础。2果梅PmARF11基因克隆及生物信息学分析。利用RT-PCR方法在从果梅品种’大嵌蒂’的早期花芽中分离克隆PmARF11,为研究果梅雌蕊发育的分子机理鉴定基础。根据梅基因组注释蛋白Pm019941设计引物,利用RT-PCR技术克隆PmARF11基因。通过生物信息学的方法进行结构功能分析,分析结果显示:PmARF11基因cDNA编码区全长为2136bp,编码711aa,预测的分子量为78.663kDa,理论等电点为5.80。亚细胞定位预测推断PmARF11基因编码蛋白定位于细胞核。3果梅PmARF11基因的功能分析。在植物中,ARF转录因子是生长素信号转导过程中的一类重要转录因子。本研究从果梅品种‘大嵌蒂’中克隆获得一条ARF基因相关cDNA序列,命名为PmARF11。成功构建了PmARF1 基因的植物表达载体,将构建好的PBI121-PmARF11载体通过农杆菌介导叶盘转化法转化烟草,获得烟草抗性植株。获得的抗性植株经过GUS、PCR、RT-PCR检测验证,初步证实获得3个转PmARF基因烟草株系。对转基因烟草株系与野生型烟草株系进行培养观察,结果发现:在相同培养条件下,转基因烟草与野生型烟草相比,叶片衰老速度加快和植株的生长周期明显延长,转基因植株烟草花与野生型相比其花器官具有一定差异,具体表现为,转基因植株花瓣深裂,颜色较深,开花期明显延长,转基因雌蕊较野生型雌蕊稍长,表明转PmARF11基因不仅参与花器官的形态建成,还能够诱导叶片衰老和延长植株生命周期。故得出结论PmARF11在植物体中是一个多效型转录因子。
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