目的:通过幼龄鼠与成龄鼠建立流感病毒(IV)感染动物模型对照实验研究以及流感病毒感染小鼠肺组织TLR4-NF-κB P65信号通路改变情况,探讨幼龄鼠与成龄鼠对流感病毒的易感性,在动物实验角度阐述“肺常不足”立论机制;将辛凉解表经典方剂银翘散与益气固表方剂玉屏风散进行比较研究,通过双表法对流感病毒感染鸡胚的保护作用以及小鼠肺组织TLR4-NF-κB P65信号通路活化程度的影响,探讨解表法与固表法在流感病毒感染防治中的作用;对辛凉解表法代表方剂银翘散采用高效液相色谱法建立指纹图谱,以期进一步明确其抗流感病毒物质基础。材料与方法:1.采用鼻腔接种甲型流感病毒鼠肺适应株A/FM1/47诱导昆明种小鼠,将实验小鼠分为幼龄鼠和成龄鼠两组,观察幼龄鼠和成龄鼠在一般状态、存活只数、肺组织病变程度等方面的差异,计算肺指数,应用RT-PCR技术检测两组小鼠肺组织中不同时点IV-RNA的病毒载量的差异。为“肺常不足”理论实质提供实验验证。2.采用免疫组织化学和RT-PCR技术检测幼龄鼠和成龄鼠肺组织中TLR4和NF-κB P65的蛋白及mRNA在不同时点的表达,比较幼龄鼠和成龄鼠感染流感病毒后TLR4-NF-κB P65信号通路的改变情况,为“肺常不足”立论提供实验佐证。3.采用血凝实验方法观察不同浓度银翘散提取物、玉屏风颗粒不同时间点体外直接抑制IV作用;研究不同浓度银翘散提取物、玉屏风颗粒对IV感染鸡胚的预防和保护作用。4.采用免疫组织化学方法,检测银翘散提取物、玉屏风颗粒及银翘散合玉屏风颗粒给药各组小鼠肺组织不同时点TLR4、NF-κB P65蛋白表达情况。5.采用RT-PCR方法,检测银翘散提取物、玉屏风颗粒及银翘散合玉屏风颗粒给药各组小鼠肺组织不同时点TLR4、NF-κB P65mRNA表达情况。6.应用高效液相色谱法建立银翘散全方指纹图谱,同时测定银翘散及单味药五种有效成分;分析银翘散指纹峰分布特征及归属情况。结果:1.接种流感病毒后,成龄模型组基本保持较好状态,幼龄模型组一般状态最差,正常组小鼠一般状态最好。接毒后14天,正常组全部存活。幼龄模型组死亡最多,在第5天达到死亡高峰,与正常组及成龄模型组比较均有显著性差异(P<0.05)。成龄模型组与正常组比较无显著性差异(P>0.05)。2.肺组织外观病变程度显示:各正常组小鼠在不同时点肺组织外观全肺野无病变;幼龄模型组肺组织病变最重,各时间点与正常组及成龄模型组比较均有显著性差异(P<0.05),第5天为幼龄模型组肺组织病变最明显时期;成龄模型组各时间点与正常组比较无显著性差异(P>0.05),与幼龄模型组有显著性差异(P<0.05)。3.肺指数测定结果:幼龄和成龄正常组小鼠在不同时点肺指数最低。幼龄模型组肺指数最高,与正常组及成龄模型组比较均有显著差异(P﹤0.05),感染第5天肺指数达到最高。成龄模型组肺指数与正常组比较无显著性差异(P﹥0.05),与幼龄模型组比较有显著差异(P﹤0.05)。4.肺组织不同时点IV-RNA的半定量测定结果:正常组小鼠各时点肺组织中未检测到IV病毒核酸,幼龄模型组在各时点均检测到大量的病毒核酸,在第5天病毒核酸量最大,为2.1238±0.2774,幼龄模型组各时间点与成龄模型组比较有显著性差异(P﹤0.05)。成龄模型组各时点IV病毒核酸只有微量表达,与幼龄模型组比较有显著性差异(P﹤0.05),与正常组比较,无显著性差异(P﹥0.05)。5.肺组织TLR4蛋白表达情况:幼龄正常组和成龄正常组均可以检测到少量的TLR4蛋白表达,且各个时点比较,蛋白表达无显著性差异(P﹥0.05)。幼龄模型组TLR4蛋白表达最强,且随着时间推移表达逐渐增强,在第5天达到峰值;幼龄模型组与正常组和成龄模型组比较,均具有显著性差异(P﹤0.05)。成龄模型组TLR4蛋白表达高于各正常组,但低于幼龄模型组。6.肺组织NF-κB P65蛋白表达情况:幼龄正常组和成龄正常组均可以检测到少量的NF-κB P65蛋白表达,且各个时点比较,蛋白表达无显著性差异(P﹥0.05)。幼龄模型组NF-κB P65蛋白表达最强,且随着时间变化表达逐渐增强,每一时间点与前一时间点比较具有显著性差异(P﹤0.05);成龄模型组NF-κB P65蛋白表达高于各正常组,但低于幼龄模型组(与正常组和幼龄模型组比较,P﹤0.05),成龄模型组蛋白表达各个时间点无显著性差异(P﹥0.05)。7.肺组织TLR4 mRNA表达情况:幼龄正常组和成龄正常组肺组织均可以检测到少量的TLR4 mRNA表达,且各个时点比较,mRNA表达无显著性差异(P﹥0.05)。幼龄模型组TLR4 mRNA表达最强,且随着病程进展表达逐渐增强,在第5天达到峰值,TLR4mRNA含量检测强度与内参比值达到1.8351±0.0110;幼龄模型组TLR4 mRNA明显高于正常组和成龄模型组,具有显著性差异(P﹤0.05)。成龄模型组TLR4mRNA表达高于各正常组,但低于幼龄模型组。8.肺组织NF-κB P65 mRNA表达情况:幼龄正常组和成龄正常组肺组织均可以检测到少量的NF-κB P65 mRNA表达,在观察第1、3、5、7天各个时点比较,mRNA表达无显著性差异(P﹥0.05)。幼龄模型组NF-κB P65 mRNA表达最强,且随着病程进展表达逐渐增强;与正常组和成龄模型组比较,具有显著性差异(P﹤0.05)。成龄模型组NF-κB P65 mRNA表达高于各正常组,但低于幼龄模型组。9.药物体外直接抑制病毒作用:银翘散提取物、玉屏风颗粒均可不同程度直接抑制甲型流感病毒FM1的活性,作用时间从1h可持续到24h,其中药物在8小时～18小时范围内抑制病毒效果显著,18小时后作用逐渐减弱;银翘散提物体外直接抑制病毒作用在8h时最强,其抑制病毒滴度可达16倍;玉屏风颗粒体外直接抑制IV作用在8-18h最强,抑制作用可持续达到8倍;银翘散提取物和玉屏风颗粒在不同时间点与西药利巴韦林对照组相比较未见优势。10.银翘散提取物、玉屏风颗粒对IV感染鸡胚的预防和治疗作用比较:银翘散提取物、玉屏风颗粒在400g/ml浓度时无论是预防给药还是治疗给药,血凝效价均比病毒对照组有明显降低,具有显著性差异(P﹤0.05);联合应用时,其血凝效价比病毒对照组均有明显降低,具有显著性差异(P﹤0.05);给药各组之间比较表明,两方合用组比单药组血凝效价低,但各组之间血凝效价因数并无显著性差异(P﹥0.05)。11.各组小鼠肺组织TLR4、NF-κB P65蛋白表达情况:各中药组TLR4蛋白表达均低于利巴韦林组,具有显著性差异(P﹤0.05)。在同一时间点,各中药组间比较,具有显著性差异(P﹤0.05),双表法组TLR4蛋白表达最低。在各个时点,中药组TLR4蛋白表达均高于正常组,但明显低于模型组,与模型组和正常组比较,均具有显著性差异(P﹤0.05)。各中药组间各时间点TLR4蛋白表达有显著性差异(P﹤0.05),双表法组在各时点蛋白表达最低。银翘散提取物组、双表法组在各个时点NF-κB P65蛋白表达均低于利巴韦林组,具有显著性差异(P﹤0.05)。玉屏风颗粒组在第1、3天蛋白表达低于利巴韦林组,具有显著性差异(P﹤0.05),第5、7天蛋白表达水平与利巴韦林组相当,无显著性差异(P﹥0.05)。各中药组间各时间点NF-κB P65蛋白表达有显著性差异(P﹤0.05),双表法组在各时点蛋白表达最低。12.各组小鼠肺组织TLR4、NF-κB P65mRNA表达情况:银翘散提取物组在第1、5天TLR4mRNA表达高于利巴韦林组,具有显著性差异(P﹤0.05),在第3、7天TLR4mRNA表达与利巴韦林组相当,无显著性差异(P﹥0.05)。玉屏风颗粒组在1、3天TLR4mRNA表达高于利巴韦林组,具有显著性差异(P﹤0.05),在第5、7天TLR4mRNA表达与利巴韦林组相当,无显著性差异(P﹥0.05)。双表法组在各时点TLR4mRNA表达均低于利巴韦林组,具有显著性差异(P﹤0.05)。各中药组间各时间点TLR4mRNA表达有显著性差异(P﹤0.05),双表法组在各时点mRNA表达最低。利巴韦林组及各中药组在各时间点NF-κB P65 mRNA表达低于模型组,高于正常组,具有显著性差异(P﹤0.05)。银翘散提取物组等各中药组在各时点NF-κB P65mRNA表达均低于利巴韦林组,具有显著性差异(P﹤0.05)。在各中药组中双表法组的NF-κB P65mRNA表达最低,与其他各组比较有显著性差异(P﹤0.05)。13.银翘散全方不同提取方法提取物色谱图共有26个共有指纹峰; 26个共有指纹峰都分别归属于9个单味药材。从色谱峰归属的数量上来看,牛蒡子、金银花、连翘所属峰占主要峰;从色谱峰的归属面积上来看,牛蒡子、甘草、金银花、荆芥占主要峰值。结论:1.通过小鼠一般状态观察、肺组织病理观察、肺组织IV-RNA的半定量测定验证,幼龄鼠可以成功塑造小鼠IV感染模型,成龄鼠不能成功造模,可以佐证“肺常不足”理论。2.幼龄鼠与成龄鼠IV感染后肺组织TLR4-NF-κB P65信号通路活化程度不同,幼龄鼠TLR4、NF-κB P65表达显著升高,成龄鼠轻度升高,二者差异显著;TLR4-NF-κB P65信号通路的过度活化,可能是幼龄鼠肺脏免疫病理损伤严重的机制之一,可以为“肺常不足“理论立论提供佐证。3.不同浓度银翘散提取物、玉屏风颗粒对IV感染鸡胚具有较好的预防和治疗保护作用,其预防和治疗作用随药物浓度降低而有所减弱;银翘散提取物、玉屏风颗粒联合应用比单药对IV感染鸡胚保护作用略强,但无显著性差异,且给药先后顺序对血凝效价因数结果无显著影响。4.银翘散提取物、玉屏风颗粒对IV感染鸡胚的预防和治疗保护作用与西药利巴韦林相当,未体现明显优势。5.银翘散提取物、玉屏风颗粒及双表法组在不同时点均能不同程度阻断流感小鼠肺组织中TLR4和NF-κB P65蛋白的高表达、抑制TLR4和NF-κB P65 mRNA的高表达。6.银翘散提取物、玉屏风颗粒及双表法组在病变过程中大部分时点对TLR4和NF-κB P65高表达的抑制作用强于西药利巴韦林,双表法抑制作用最强。7.辛凉解表法、益气固表法及双表法对流感病毒感染小鼠的防治作用与抑制流感病毒感染小鼠肺组织TLR4-NF-κB P65信号通路的过度活化有关。8.高效液相色谱法同时测定银翘散全方不同提取方法提取物中五种活性成分,方法简便,重现性好。银翘散全方指纹图谱共有26个共有指纹峰,分别归属银翘散全方中九味药材;共有峰的相对保留时间及峰面积比值,可以为明确银翘散复方抗IV作用物质基础提供重要依据。