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目的:本研究将比格犬的DPSCs和PDLSCs进行体外分离、培养、鉴定,比较分析两种干细胞的不同特性,并分别将cDPSCs和cPDLSCs复合PGA支架并接种在TDM表面,异位移植于比格犬的肾囊膜下,观察并比较两者在TDM周围牙周支持组织样结构的形成情况。方法:1.采用酶消化法分离培养比格犬的DPSCs和PDLSCs,倒置显微镜下观察细胞形态;克隆形成率和CCK 8检测法评价增殖能力;通过细胞免疫组化鉴定细胞来源;流式细胞术检测两种细胞表面标志物;成骨、成脂及成软骨诱导检测两种细胞多向分化的能力。2.分别将cDPSCs和cPDLSCs复合PGA支架并接种在TDM表面,体外静态力学刺激培养2周,倒置显微镜下观察细胞与支架的生物相容性。3.用慢病毒介导的GFP转染cDPSCs,倒置荧光显微镜下观察cDPSCs形态、生长情况及GFP荧光的表达强度,并将其复合PGA支架同方法2。4.将体外力学刺激培养2周的cDPSCs-PGA-TDM、cPDLSCs-PGA-TDM、PGA-TDM(空白组)及cDPSCs-GFP-PGA-TDM,异位移植于比格犬的肾囊膜下。术后8周取材,常规的固定、脱钙、包埋、切片。HE、Azan染色观察TDM周围牙周支持组织形成的情况。通过免疫组织化学法检测牙骨质蛋白1(CEMP1)、I型胶原(COL-I)及骨膜蛋白(periostin,PN)表达的情况,进一步鉴定TDM周围的组织是否为牙骨质/牙周韧带样结构。并通过免疫荧光GFP检测TDM周围的组织是否来源于我们所植入的细胞。结果:1.cDPSCs与cPDLSCs原代培养均呈克隆样生长,形态多为为短梭形,体积稍小,胞体丰满。但cPDLSCs生长速度较cDPSCs慢,培养周期较长,形成的集落相对较少。克隆形成能力显示,cDPSCs的克隆形成率(7.3±1.2)%显著高于cPDLSCs克隆形成率(3.4±0.4)%,具有统计学差异。且cDPSCs形成的集落面积较大,细胞数目较多。cDPSCs、cPDLSCs的增殖曲线,符合细胞对数生长曲线,呈现明显的“S”形,cDPSCs的增殖能力强于cPDLSCs。细胞免疫组化显示,两种细胞均表达波形丝蛋白,不表达角蛋白。同时,cDPSCs和cPDLSCs都表达间充质干细胞表型STRO-1、CD 146、CD 105、CD 90,不表达造血干细胞CD 45。cDPSCs和cPDLSCs均有多向分化的能力,其中,成骨的定量分析显示:cPDLSCs矿化结节形成量(2.62±0.06)明显高于cDPSCs(2.11±0.07),说明体外形成钙化结节的能力cPDLSCs强于cDPSCs(P<0.05)。2.细胞接种在TDM上,1周后,倒置显微镜下观察,牙本质块边缘可见较多的细胞附着,复层生长,且生长良好。细胞在PGA支架上粘附良好,沿着PGA纤维伸展,分泌丰富的细胞外基质,形成网状样结构。3.慢病毒介导的GFP转染cDPSCs 72 h后,倒置荧光显微镜下观察,细胞的转染率约70%-80%左右,形态、增殖能力无明显改变。4.移植肾囊膜下,8周后取材,组织学观察到cDPSCs组和cPDLSCs组中均可形成不均量的矿化沉积物及类似平行/斜行纤维样组织,似牙骨质/牙周韧带样组织。而空白组中形成了少量、较松散的纤维样组织。免疫组化检测,TDM周围形成的组织阳性表达CEMP1、COL-I及Periostin,说明cDPSCs组和cPDLSCs组均可形成牙骨质/牙周韧带样组织。免疫荧光GFP检测,TDM周围的组织阳性表达,证明其周围生成的组织来源于我们所植入的细胞。结论:1.本实验体外分离培养的cDPSCs和cPDLSCs均具有间充质干细胞的特性。2.细胞接种到PGA-TDM复合支架上,生物相容性好。3.比格犬异位牙周组织再生模型中,cDPSCs组和cPDLSCs均具有形成牙骨质样结构及牙周韧带样组织的潜能。