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研究目的:预防和治疗再狭窄是当今研究的热点。再狭窄形成的始动因素是内皮损伤和剥脱,然而成熟内皮细胞修复能力有限,而近来发现内皮祖细胞(EPCs)是进行内皮修复的种子细胞。由于EPCs在疾病状态或冠心病危险因素存在时,数量不但减少,而且存在功能低下。因此,有必要探索使其数量增加,提高功能的有效方法。他汀类和过氧化物酶增殖物激活体γ激动剂在糖尿病患者伴高胆固醇血症中应用较广,故设想两药联用是否更有利于提高EPCs数量和功能,以实现对EPCs进行“药物修饰”,而且细胞经“药物修饰”后,是否更有利于防治再狭窄,目前该方面的报道国内外甚少。冠心病危险因素影响EPCs数量和功能的确切机制尚不清楚,氧化应激在再狭窄和动脉粥样硬化中起了主要作用,其是否参与对EPCs进行负相调节,目前未见报道。因此,本研究将观察阿托伐他汀和罗格列酮对EPCs数量和功能的影响以及对内皮修复的作用,并初步探讨影响EPCs数量和功能的可能机制。第一部分高胆固醇血症兔外周血内皮祖细胞的培养特性及相关机制的研究材料与方法:12只雄性新西兰大白兔分为2组:正常组和高胆固醇血症组。从兔耳中央动脉抽取的血按密度梯度离心法分离单个核细胞,EBM-2培养基(含20%胎牛血清,EGM-2MV Single Quots)培养3-4周。采用双荧光染色法、流式鉴定和免疫组化鉴定细胞为EPCs。MTT法、黏附能力检测和Griess法测定细胞增殖、黏附、分泌一氧化氮(NO)的能力。比色法测定细胞超氧阴离子(O2.-)的浓度、内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)和NADPH氧化酶的活性。RT-PCR法检测细胞eNOS和NADPH氧化酶p22phox的mRNA表达。结果:细胞流式仪发现体外分离培养的细胞高表达CD34,免疫组化法进一步发现该类细胞还可表达内皮系特异标志vWF;同时该类细胞也能摄取ac-LDL和结合UEA-1,提示本实验已成功分离和体外培养出兔外周血EPCs。与正常组相比,高胆固醇血症组兔EPCs的数量( 30.43±1.76 vs 50.18±6.83)/ (视野×200) (P<0.05),增殖能力(0.43±0.05 vs 0.65±0.01)、黏附能力(22.33±3.51 vs 45.33±2.52)/ (视野×200)和分泌的一氧化氮(9.89±1.51.vs 33.37±6.99μmol/L)明显降低;但O2.-浓度高于正常对照组(108.68±15.07 vs 61.74±6.23 U/L)。高胆固醇血症组兔EPCs的eNOS mRNA表达较正常组明显降低(0.563±0.091 vs 0.998±0.267,P<0.05),而NADPHp22phox mRNA则较正常组显著升高(1.730±0.071 vs1.016±0.070,P<0.05)。EPCs的eNOS活性显著低于正常对照组(0.447±0.130 vs 0.744±0.066 U/ml,P<0.05),NADPH氧化酶的活性在高胆固醇血症组显著升高(5.330±0.657 vs 2.174±0.231 pmol-1·min-1·mg-1,P<0.05)。结论:高胆固醇血症时EPCs的数量减少和功能(增殖、迁移和分泌)受损;氧化应激参与影响其数量和功能。第二部分罗格列酮和阿托伐他汀对兔内皮祖细胞数量和功能的影响材料与方法:动物分组、EPCs的鉴定和培养同第一部分实验。EPCs共分11组:正常对照组(N);高脂饮食组(C);罗格列酮组(按浓度梯度分为0.01μM,0.1μM,1μM,10μM四组)、阿托伐他汀组(按浓度梯度分为0.01μM,0.1μM,1μM,10μM四组)、1μM罗格列酮联合1μM阿托伐他汀组。检测EPCs的数量和功能(增殖、黏附、分泌NO)。ELISA法测定EPCs分泌的血管内皮生长因子(VEGF)浓度。RT-PCR法测定EPCs eNOS、NADPH氧化酶p22phox和PPARγ的mRNA表达。结果:1.0.01μM至1μM浓度时,罗格列酮呈浓度依赖性提高高胆固醇血症兔EPCs的数量、增殖、黏附和分泌VEGF及NO功能。而10μM罗格列酮未进一步提高EPCs数量和功能。2.0.01μM至1μM浓度时,阿托伐他汀呈浓度依赖性提高高胆固醇血症兔EPCs的数量、增殖、黏附和分泌VEGF及NO功能。而10μM阿托伐他汀未进一步提高EPCs数量和功能。3.1μM罗格列酮联合1μM阿托伐他汀组,较1μM阿托伐他汀和1μM罗格列酮更进一步提高EPCs的数量(50.50±4.04 vs 45.98±5.08, 44.08±3.70, P<0.05)和功能(增殖:0.61±0.02 vs 0.52±0.03和0.50±0.03, P<0.05;黏附:40.67±2.08 vs 30.67±1.53和30.67±0.58, P<0.05;分泌:VEGF, 120.76±12.59 vs 88.10±12.52和84.25±13.75, P<0.05),对分泌NO功能虽无显著进一步增强(24.74±4.27 vs 18.16±1.70和15.05±2.85, P>0.05),但有增加的趋势。4.1μM阿托伐他汀和1μM罗格列酮均可分别使高胆固醇血症组eNOS表达增加60%和23%。两者联合干预则使表达增加94%,较单药增加更为明显(P<0.05),且与正常组无差异(P>0.05)。1μM阿托伐他汀和1μM罗格列酮分别干预后均使NADPHp22phox mRNA表达下降(P<0.05),联合干预后则进一步下降,但仍高于正常组(P<0.05)。高胆固醇血症组兔EPCs的PPARγmRNA表达与正常组无差别(P>0.05),而且1μM阿托伐他汀组不影响其表达(P>0.05)。1μM罗格列酮及1μM罗格列酮和1μM阿托伐他汀联合用药组较高胆固醇血症和正常组高(P<0.05)。结论:罗格列酮联合阿托伐他汀可协同提高EPCs数量和改善功能,实现体外对EPCs进行“药物修饰”。第三部分罗格列酮联合阿托伐他汀修饰内皮祖细胞移植对内皮修复的研究材料与方法:25只雄性新西兰大白兔随机分为4组:正常组(N, n=10)、损伤未干预组(C, n=8)、EPCs移植组(E, n=8)和药物干预EPCs移植组(ME, n=8)。药物干预EPCs指EPCs经1μM罗格列酮联合1μM阿托伐他汀预处理24小时。除正常组给予正常饲料外,其余各组均给予含0.5%胆固醇和6%花生油的高脂饲料喂养。损伤未干预组、EPCs移植组和药物干预EPCs移植组行颈动脉球囊损伤术。而正常组仅切开颈部皮肤。细胞移植前用Dil标记。4周末行伊文氏蓝染色,计算内皮再生面积与损伤总面积比(An/At)评价再内皮化率;取损伤段血管行苏木素-伊红染色,计算内膜与中膜比值(I/M);免疫组化检测血管壁α-SMA表达。结果:1. EPCs移植组和药物干预EPCs移植组在荧光显微镜下均发现损伤部位有Dil标记的移植的EPCs。而正常组与损伤未干预组未见荧光细胞表达。表明EPCs归巢于受损血管处。2.EPCs移植组的再内皮化率较未损伤干预组显著提高(75.57±4.03% vs 51.66±1.69, P<0.05%),而药物干预组则进一步提高(93.38±2.41% vs 75.57±4.03%, P<0.05)。3.与正常组相比,损伤未干预组I/M显著升高(1.80±0.16 vs 0.28±0.03,P<0.05);EPCs移植组I/M较损伤未干预组显著降低(1.31±0.22 vs 1.80±0.16,P<0.05);而药物干预EPCs移植组则使I/M进一步降低(0.51±0.08 vs 1.31±0.22,P<0.05)。4.与正常组相比,未损伤干预组α-SMA表达显著增加,EPCs移植组使α-SMA表达下降,而药物干预EPCs移植组则进一步下降。结论:EPCs移植可以定位于颈动脉损伤段,加速内皮修复,抑制内膜增生,延缓再狭窄。药物修饰EPCs移植可进一步加速再内皮化,提高抑制内膜增生疗效和防治再狭窄。第四部分罗格列酮和阿托伐他汀动员内皮祖细胞对内皮修复的影响及相关机制的研究材料与方法:40只雄性新西兰大白兔随机分为5组:正常组(n=8)、损伤未干预组(n=8)、罗格列酮组(n=8,1mg/kg/d)、阿托伐他汀组(n=8,5mg/kg/d)和罗格列酮联合阿托伐他汀组(n=8,1mg/kg/d罗格列酮和5mg/kg/d阿托伐他汀)。除了正常组均于高脂饮食2周后行颈动脉球囊损伤术(同第三部分实验),术后继续高脂饮食;正常组仅切开颈部皮肤,给予正常饲料,均共4周。术后4周末用流式细胞仪测量外周血中CD34和KDR双阳性的细胞为循环EPCs。生化法检测TC、TG、LDL-C、HDL-C和空腹血糖(Glu)。Griess法测定NO浓度,比色法测定血管壁O2.-。行伊文氏蓝染色,计算内皮再生面积与损伤总面积比(An/At)评价再内皮化率;行苏木素-伊红染色,计算内膜与中膜比值(I/M);免疫组化检测血管壁α-SMA表达。扫描电镜观察血管壁的内皮修复情况。RT-PCR法检测血管壁eNOS和NADPH氧化酶p22phox的mRNA表达。结果:1.罗格列酮组服药后TC、LDL、TG、HDL和Glu不受影响。阿托伐他汀组的TC和LDL较损伤未干预组明显下降(P<0.05),但TG、HDL和Glu无明显改变(P>0.05)。罗格列酮联合阿托伐他汀组TC和LDL较损伤未干预组和罗格列酮组显著降低(P<0.05),但降低水平与阿托伐他汀组无差别(P>0.05),其对TG、HDL和血糖也无影响。2.损伤未干预组的EPCs数量较正常组降低了40%;罗格列酮组和阿托伐他汀组均使EPCs数量升高,分别增加了57%和65%,且与正常组无差异(P>0.05);药物联合组则使EPCs数量进一步提高,增加了1倍(P<0.05)。3.正常组内皮细胞完整覆盖内膜,沿着血流方向排列;损伤未干预组内皮细胞大片剥脱;罗格列酮组和阿托伐他汀组仍有少许内皮剥脱,但较损伤未干预组少;罗格列酮联合阿托伐他汀组则内皮覆盖完全,但内皮细胞排列较正常组紊乱。4.与正常组相比,损伤未干预组I/M显著增高(0.28±0.03 vs 1.80±0.16,P<0.05),提示内膜增生形成;与损伤未干预组比较,罗格列酮组I/M显著降低(1.80±0.16 vs 0.57±0.03, P<0.05);阿托伐他汀组也使I/M降低(1.80±0.16 vs 0.51±0.06, P<0.05);而联合药物治疗后,使I/M降至正常水平(0.28±0.03 vs 0.37±0.06, P>0.05)。5.与正常组相比,未损伤干预组α-SMA表达显著增加;罗格列酮组和阿托伐他汀组均分别使α-SMA表达下降,而药物联合干预组则使α-SMA进一步下降。6.损伤未干预组较正常组血清NO水平降低83%(P<0.05),罗格列酮组和阿托伐他汀组NO水平分别较损伤未干预组升高了30%和38%,罗格列酮联合阿托伐他汀组使NO进一步升高了62%,但仍低于正常组水平(P<0.05)。损伤未干预组抗超氧阴离子(O2.-)能力较正常组下降了约1.7倍;罗格列酮使其抗O2.-能力提高了1倍(P<0.05);阿托伐他汀组则提高了87%(P<0.05);两药联合提高了1.5倍(P<0.05),且与正常组无差别。7.损伤未干预组eNOS的mRNA表达较正常组明显降低(P<0.05);罗格列酮组和阿托伐他汀组均分别使损伤未干预组eNOS的mRNA表达上调(P<0.05);药物联合治疗后,eNOS的mRNA表达进一步升高,但未回复正常。相反,NADPHp22phox mRNA在损伤未干预组呈明显高表达,较正常组升高了1倍(P<0.05),罗格列酮组和阿托伐他汀组均使损伤未干预组表达下降(P<0.05)。罗格列酮联合阿托伐他汀组也使损伤未干预组NADPHp22phox mRNA表达显著降低,且降至正常水平。结论:罗格列酮在体内动员EPCs,是不依赖于其调脂和降糖作用,阿托伐他汀在调脂的同时,动员EPCs,联合用药后EPCs动员增强;罗格列酮和阿托伐他汀均在转录水平降低NADPH氧化酶和增加eNOS的表达,从而减少ROS的生成,提高了NO的利用度,两药联合应用后进一步提高NO水平,提高清除O2.-能力,发挥抗氧化应激作用;联合用药较单药加速内皮化,抑制内膜增生防治再狭窄。