胰腺癌细胞来源的exosomes的提取、鉴定及体内分布的初步研究

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目的:证实体外培养的胰腺癌细胞可分泌exosomes,初步分析胰腺癌来源的exosomes在小鼠全身分布情况。  方法:1、对不同转移潜能的胰腺癌细胞株panc-02,panc-02-H7进行体外培养,收集上清液,采用差速离心联合蔗糖梯度离心法提取纯化exosomes,通过BCA蛋白质定量法对exosome进行间接定量。并在电镜下使用液相载网法,观察exosomes的形态,以及用Western Blot对其分子标志物进行鉴定。2、利用共聚焦荧光成像技术,观察PKH67绿色荧光标记的exosomes在小鼠各个主要脏器的分布情况。  结果:1、不同肝转移潜能的胰腺癌细胞株panc-02,panc-02-H7均可以产生exosomes。通过电镜观察发现,两种exosomes在形态上并没有明显差异,均呈现为圆形或椭圆形的囊泡状结构,大小较为均一,直径大多集中在50~150nm之间。Western Blot显示,两种exosomes都表达exosomes特异性分子标志蛋白,CD9、MHC-Ⅰ、TSG101,却不含凋亡小体蛋白Cytochrome C。电镜形态学鉴定和Western Blot分子标志物鉴定两者符合性良好。BCA蛋白质定量是较为简便的exosomes的定量方法,并且结果显示等量细胞来源的exosomes的蛋白含量,高肝转移潜能的panc-02-H7高于panc-02(P<0.05)。2、通过共聚焦观察,在小鼠肺、肝、脾、骨髓和脑中能明显的观察到有绿色荧光标记的exosomes分布,相对于其他脏器,肝、脾的分布较多。而单就体内分布,两种exosomes没有明显差异(P>0.05)。  结论:1、证实了体外培养的不同肝转移潜能的胰腺癌细胞均可分泌典型exosomes。2、等量高转移潜能胰腺癌细胞来源的exosomes的蛋白含量高于低转移潜能胰腺癌细胞来源的exosomes。3、不同肝转移潜能的胰腺癌细胞来源exosomes,在体内肝、脾、肺、骨髓、脑等主要脏器都有分布。
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