研究目的非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)是临床上最为常见的恶性肿瘤之一，寻找有效的肺癌诊断标志物一直是国内外研究的重要课题。癌细胞在发生、生长中可以分泌某些蛋白质进入血液，理论上讲，血清中肺癌细胞分泌蛋白可能伴随肺癌的发生而出现；且其血清浓度可能与肺癌细胞的异常增殖和／或其在癌细胞中的异常表达量密切相关。因此，肺癌细胞分泌蛋白是潜在的肺癌血清标志物，且对肺癌的早期筛选可能具有重要意义。本研究旨在通过鉴定非小细胞肺癌细胞的分泌蛋白，进而筛选出非小细胞肺癌的血清蛋白标志物。研究方法1．非小细胞肺癌分泌蛋白标本的提取及制备：培养非小细胞肺癌细胞系A549，收集培养液上清，同时收集同等体积空白细胞培养液做对照，采用脱氧胆酸盐—三氯醋酸沉淀法对培养液中的蛋白进行沉淀。细胞裂解液溶解蛋白沉淀，低温高速离心后吸取上清，即为A549细胞分泌蛋白样品及对照样品。蛋白样品比色法测定蛋白浓度后置于—70℃冰箱中保存备用。分泌蛋白标本及对照标本各3份。2．分泌蛋白的分离及鉴定：2．1 2-DE与凝胶图像分析：第一相固相pH梯度等电聚焦：A549细胞分泌蛋白样品及对照样品各1200μg与水化液、痕量溴酚蓝混合为450μl上样液，加入IPGphor持胶槽中，最后置入24cmIPG线性干胶条(pH3-10 L)。在20℃进行等电聚焦，参数设置为：(1)30V，12h；(2)500V，1h；(3)1000V，1h；(4)8000V，8.5h。等电聚焦结束后在平衡液中平衡共30min，在20℃进行第二相SDS-PAGE电泳。双向电泳后的A549细胞分泌蛋白样品凝胶(A549凝胶)及对照样品(对照凝胶)用胶体法考马斯亮蓝染色，使凝胶中的蛋白质点可视化。Imagescanner扫描仪对考马斯亮蓝染色的2-DE胶扫描，并存储为数字图像。A549凝胶及对照凝胶的双向电泳图使用PDQuest 2DE软件进行成组比较，A549凝胶上特有的蛋白质点即为A549分泌蛋白相关的蛋白质分子。2．2 A549凝胶上特有的蛋白质点MALDI-TOF分析与数据库检索：切取A549凝胶内的特有蛋白质点，经脱色，DTT还原和碘乙酰胺烷基化，TPCK-胰蛋白酶酶解、萃取及浓缩后获得质谱分析样品。点样后用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪(matrix associated laster desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)检测，获得肽质指纹图谱(peptide mass fingerprinting，PMF)，采用Matrix Science的Mascot软件检索MSDB和SWISS-PROT数据库，鉴定蛋白。3．高表达非小细胞肺癌分泌蛋白的筛选收集15例经病理确诊、进行手术治疗的NSCLC患者癌组织及癌旁肺组织(距癌边缘大于5cm)标本。设计各分泌蛋白的引物序列，应用RT-PCR方法分析分泌蛋白mRNA在肺癌组织及肺组织中表达差异。4．分泌蛋白二氢二醇脱氢酶(DDH)的Western blot验证以往的研究发现二氢二醇脱氢酶(DDH)是胞浆蛋白，且在肺癌组中有较高的表达，因此本研究选择DDH做进一步检测。A549细胞培养液上清蛋白及对照蛋白样品按分子克隆试验指南的方法进行：每孔上样量为50μg，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离及转膜，蛋白转移至PVDF上，封闭，一抗(抗DDH抗体)孵育，洗涤，二抗温育，PBS洗涤，最后用ECL试剂发光及显影。5．分泌蛋白DDH在非小细胞肺癌组织中的表达分析15例收集的NSCLC癌组织及癌旁肺组织标本，蛋白提取后，SDS-PAGE分离，采用Western blot分析肺癌组织及肺组织的DDH表达差异。同一批标本部分福尔马林固定、石蜡包埋，切片，应用免疫组化方法检测蛋白的表达差异及表达部位。6．分泌蛋白DDH在非小细胞肺癌患者血清中ELISA检测收集NSCLC患者(64例)、肺部良性肿瘤患者(20例)及健康人血清(20例)，间接法ELISA检测血清DDH，测定吸光度值。研究结果1．A549分泌蛋白相关分子的鉴定：应用PDQuest 2DE软件分析A549凝胶及对照凝胶，结果示其重复性好。在分子量大于66kDa区域，蛋白点成片状，两胶比较无明显区别。在分子量小于66kDa区域，A549凝胶上共检测到248个蛋白质点，对照胶上有217个点，经成组比较发现共同点有182个，只存在于A549凝胶图中的特有蛋白质点有66个。对A549凝胶上特有蛋白质点进行胶内酶解、MALDI-TOF-MS分析，共获得了66张肽质量指纹图。利用Matrix Science的Mascot查询软件检索MSDB和SWISS-PROT数据库，发现有统计学意义的蛋白质结果共45个，其中属于牛的蛋白28个，包括白蛋白、球蛋白等的前体及裂解产物、Bos taurus carbonic anhydrase，胎牛血红蛋白β链，牛补体C4，牛Apolipoprotein A-I precursor等。属于人的蛋白质点17个，共14种蛋白，包括α肌动蛋白、γ肌动蛋白，α烯醇酶(EN01)，锰—超氧化物歧化酶(MnSOD)，谷胱苷肽S转移酶P(GSTP1-1)，二氢二醇脱氢酶(Dihydrodiol dehydrogenase，DDH)，磷酸甘油酸变位酶(PGAM1)、葡萄糖依赖性胰岛素释放肽受体(GIPR)，肽基脯氨基顺反异构酶(PPIA)，磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)，蛋白基因产物9.5(PGP9.5)，Peroxiredoxin 1(PDX1)，β-半乳糖苷结合蛋白1(Galectin-1)及专利蛋白W00222660等。2．高表达非小细胞肺癌分泌蛋白的筛选利用RT-PCR的方法对部分鉴定的分泌蛋白进行筛选，发现在非小细胞肺癌组中mRNA高表达的分泌蛋白有α烯醇酶，DDH，磷酸甘油酸变位酶，肽基脯氨基顺反异构酶(PPIA)，磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)，Peroxiredoxin 1，蛋白基因产物9.5等。3．分泌蛋白DDH验证A549细胞总蛋白、A549细胞分泌蛋白样品及对照样品进行蛋白印迹检测，结果在A549细胞分泌蛋白样品及A549细胞总蛋白中均检测到DDH的存在，而对照样品中为阴性。4．DDH在非小细胞肺癌组织中蛋白表达差异性分析收集非小细胞肺癌组织和癌旁肺组织，应用抗DDH抗体进行蛋白印迹及免疫组化检测。结果发现DDH在肺癌组织中高表达，肺癌细胞胞浆及细胞膜上均有丰富的DDH存在。6．DDH的血清ELISA检测血清ELISA检测发现NSCLC患者血清中DDH的浓度较健康人和肺部良性肿瘤患者均高，且差异有显著性。研究结论1．本研究在国内外首次对肺癌细胞分泌蛋白进行了研究，鉴定出A549细胞的分泌蛋白包括：α肌动蛋白、γ肌动蛋白，α烯醇酶(EN01)，锰—超氧化物歧化酶(MnSOD)，谷胱苷肽S转移酶P(GSTP1-1)，二氢二醇脱氢酶(DDH)，磷酸甘油酸变位酶(PGAM1)、葡萄糖依赖性胰岛素释放肽受体(GIPR)，肽基脯氨基顺反异构酶(PPIA)，磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)，蛋白基因产物9.5(PGP9.5)，Peroxiredoxin 1(PDX1)，Galectin-1等。2、RT-PCR检测发现DDH、PGAMl、PPIA、PEBP、PGP9.5、PDX1、ENO1 mRNA在非小细胞肺癌组织中有不同程度高表达，首次发现ENO1及PEBP在NSCLC中高表达。3、首次发现DDH是非小细胞肺癌的分泌蛋白，并首次发现NSCLC细胞膜上有丰富的DDH存在。4、与以往的研究相同，本研究发现DDH是非小细胞肺癌的肿瘤标志物。本研究还首次发现DDH是非小细胞肺癌的血清标志物。5、本研究为NSCLC血清标志物的筛选提供了新的候选分子，且本研究提示通过鉴定肺癌细胞分泌蛋白来筛选血清标志物是可行、有效的方法。